(流体ガス力学)
ダイレクトシールジャンプによる移行中のガスパラメータの変化
衝撃の前と衝撃後の流速の間の関係を確立してみましょう。 この目的のために、次の形式で動的方程式 (§ 10.7 を参照) を書き直してみましょう。 R2 R そして і - そして2 ~ (10.64) r2i2 RShchベルヌーイの方程式 (10.15) と (10.24) を衝撃の前後に適用すると、次の結果が得られます。(流体ガス力学)
革命的変革と「大躍進」
外国資本と官僚資本に対する中国革命は 1924 年から 1949 年まで 25 年間続き、3 つの内戦と日本に対する民族解放戦争で構成されていました。 それは 1949 年の中華人民共和国の宣言によって終わりました。 25年間、中国では戦争が絶えなかった…(経済史)
サンドイッチ壁および屋根パネル
サンドイッチ パネルは効果的な建築材料です。 「サンドイッチ」高い断熱品質と周囲の構造に特徴的な他の特性（機械的強度、...（軽工業企業の設計の基礎）
リネン生地の加工
繊維材料の改質方法人類は常に、体の健康を維持し維持する方法を見つけるために努力してきました。 皮膚の状態は健康にとって非常に重要です。 したがって、繊維素材には長い間注目が集まってきました。繊維材料の改質方法
人類は常に、体の健康を維持し維持する方法を見つけるために努力してきました。 皮膚の状態は健康にとって非常に重要です。 そのため、常に人の肌に触れるものである繊維素材への注目が高まっています。（リネン生地の身体への適応効果）
成功したマネージャーが従業員にフィードバックを与えるときに使用する 7 つの重要なルールについて説明しました。 この資料では、そのような会話を効果的に構築できるようにするいくつかのモデルを見ていきます。 便宜上、例を使用します。
フィードバックの「サンドイッチ」
最も有名なモデルであり、広く使用されています。 理解しやすく、覚えやすく、使いやすい。
説明：発達フィードバック ブロックは 2 つの正のフィードバック ブロックの間に位置します。 したがって、「サンドイッチ」という名前が付けられました。 目標の設定、結果の調整、従業員の育成に関する会話で使用されます。 通常、従業員の行動の調整が必要な懲罰的な会話、違反を伴う状況、義務の不履行などには使用されません。
状況：営業部門の従業員であるセルゲイ氏は、2 つの指標 (販売量とアクティブな顧客の数) に従って計画を達成しました。 しかし、新製品の販売目標は50％しか達成できていない。
例：
肯定的な評価から始めましょう。
「セルゲイ、今月は販売数量計画を 100% 達成したベストセラーのグループにあなたが含まれていることを嬉しく思います。 あなたは懸命に働き、多くのクライアントとの関係を築かなければならなかったのですね。あなたはアクティブなクライアントの数という点でもリーダーです。」 このような励ましの言葉の後、従業員は改善が必要な業務領域について話し合う準備が整います。
改善や変更が必要なものを話し合い、行動計画に同意します。
「同時に、まだ成長の余地もあります。 新ブランドの売れ行きに注目だ。 今月は計画の半分しか達成できませんでした。 同社にとって今重要なのは、この製品を市場に投入することです。 来月、この指標を改善するために何ができるか話し合いましょう。」 批判はありませんのでご了承ください。 対話と建設的な議論が行われます。
会話を前向きな雰囲気で終わらせましょう。 「なるほど、計画は合意されました、さあ、行動しましょう。 クライアントと協力するあなたの能力があれば、この仕事をやり遂げることができると確信しています。 覚えておいてください: 新しいブランドの売上を増やすと、現在進行中のコンテストで上位 3 位の受賞者に参加できるようになります。 助けが必要な場合は入ってください。」
B.O.F.F.
説明：モデルの 4 つの段階の英語名の頭文字の略称。 行動（行動）－結果（結果）－感情（感情）－未来（未来）。
状況：顧客サービス部門の新入社員であるイリーナは、定期的に質の高いサービスの基準に違反しています。つまり、顧客に挨拶しない、失礼な態度をとる、顧客の要求を無視する、電話に出ない、昼休みに遅刻するなどです。
例：
行動。
イリーナに彼女の仕事についてのあなたの意見を伝えてください。 具体的には、事実を、できれば観察の日付などの詳細を含めて表現します。 理由について話し合います。 場合によっては、従業員が自分に何を期待されているかを十分に認識していない場合があります。
結果。
イリーナの行動 (クライアントと仕事をするときのイライラや無礼、要求の無視、休憩後の長時間の欠勤) が業績、クライアントからの苦情の数、サービスを受けたクライアントの数にどのような影響を与えるかをイリーナと話し合います。
感情。
イリーナがこのように働いていることを知ってどのように感じるかについて話してください。 あなたは動揺し、悲しく、あまり幸せではなく、それを認識するのは不快です。 イリーナが長期間仕事を離れ、追加の仕事量を抱えて働かなければならない場合に、他の従業員がどのように感じるかについて話し合います。 そうすることで、イリーナが自分の行動が受け入れられないことを理解できるようになります。
未来。 この行動をなくすために今後何ができるかをイリーナと話し合ってください。 質問して従業員から答えを得るのが最善です。 これにより、彼女は将来の決定と行動に責任を持つことができるようになります。 会話の最後に、具体的な行動と期限について合意し、将来の行動計画の概要を示します。 そして、イリーナが行う自分自身の作業を要約する会議の日付をスケジュールすることを強くお勧めします。
説明：標準 - 観察 - 結果。
状況：テクニカル サポート センターの従業員であるアンドレイ氏は、ビジネス開発部門からのトラブルシューティングの要請に応じませんでした。
例：
標準。
設定された基準を思い出してください。 「2 年目になりますが、私たちの部門では迅速な対応基準を設けています。どのようなリクエストにも 15 分以内に対応する必要があります。 これは、必ずしもこの 15 分以内に障害が解決されるという意味ではありませんが、お客様は申請が受理され、作業が開始されたという応答を受け取ることになります。」
観察。
事実と観察を述べます。 「昨日の 10 時 25 分に事業開発部門から受け取った申請書について、顧客は今日の初めまで応答を受け取りませんでした。 問題は解決されていません。まだシステムにアクセスできません。」
結果。 ビジネス、チーム、顧客、従業員に対する行動の影響について話し合います。 「その結果、事業開発部門は昨日、準備に必要な情報を入手できず、主要顧客との交渉を延期せざるを得なくなりました。 これは当社にとって重要な顧客であり、当社の低迷のせいで彼らが競合他社との交渉を開始しないという保証はありません。」
次のステップは、従業員が自分自身の行動を変えることを約束することであるのは論理的です。
説明：成功 - 教訓 (学習) - 変化 (変化)。 このフィードバック モデルは、チーム作業、つまり最終結果や中間結果をまとめるときのプロジェクト グループの作業、チーム ミーティングによく適合します。
状況：プロジェクト チームは、新しいシステムの開発の第 1 段階を完了しました。
例：
プロジェクト チームの各メンバーに、プロジェクト中に達成した最も重要な個人的成果 2 つ、学んだ最も重要な教訓 1 つ、プロジェクトの第 2 フェーズで行う必要があった変更 1 つを挙げてもらいます。 それからみんなに意見を言ってもらいましょう。 リストを作成し、最も重要な成果を 5 つ、教訓を 2 つ、最も重要な変更を 1 つ選択します。 リスト内の項目の数は、状況やプロジェクト チームの規模によって異なる場合があります。
もちろん、従業員との会話を組み立てる方法は他にもたくさんあります。 この記事では、最もよく知られ、実際に使用され成功しているフィードバック モデルの概要を説明します。
顧客は商品の価値が価格よりも高い場合に商品を購入します。 価値があれば、興味も生まれます。 この場合、製品の需要を決定する基準となるのは価格です。
価格を言うと、「ありがとう、考えます」と言われます。 しかし、オファーに十分なメリットを追加すれば、その価値は価格を上回るでしょう。
サンドイッチ方式の販売
この場合、価格はバターのようなもので、値の上に薄い層で「広がり」ます。 営業におけるサンドイッチ方式です。
この手法は 2 つのバージョンで使用されます。 たとえば、価格に名前を付けて、この価格に何が含まれているかを示します。
「商品の価格は××です。 この価格にはデバイス自体と交換部品一式が含まれます。 配送・設置も無料で承っております。 当社が提供する保証は、同様の製品のほとんどの場合のように 1 年ではなく、3 年間です。」
またはその逆 - 最初に利点について話し、後で使用するために価格を「保存」します。 たとえば、ある有名な企業は Web スペシャリスト向けのコースを提供しました。 名刺のページには、即戦力スペシャリストの高水準の収入と高い需要、多くの業界で役立つ一連のスキル、短いトレーニング時間、大企業でのインターンシップなど、オファーの詳細が記載されています。 説明には、コースをマスターするために必要なのは欲望だけであると書かれています。 学習プロセスは簡単です。必要なのはインターネット接続だけです。 学生のかなりの部分は、在学中にこの分野で自分の可能性を実現する機会を見つけています。 トレーニングを完了したユーザーからのフィードバックも提供されます。
ページの最後には、名刺がすべての利点と残りの場所の数のリストの形でもう一度まとめられています。 そして、申請フォーム自体の直前に、価格が表示されます-コースは無料ではないことがわかります。 しかし、興味のあるユーザーが価格に到達するまで、すべての利点を知る機会があります。
サンドイッチ方式の販売
販売におけるサンドイッチ方式は少し異なります。価格をオファーの中央に「配置」します。 最初に「利点」、つまり利点、価格について説明し、最後にさらに利点を追加します。 心理的効果の計算 - 複数の引数がある場合、最初と最後の引数が記憶されます。 途中で出てくる議論はクライアントの注意を「外して」しまいます。
サンドイッチ法は実際にはどのように見えるか:
上の例は、価格が発表された後にさらにいくつかの「特典」が追加されるオンライン コースの提供に関するものです。 たとえば、資格の高い教師、開発されたフィードバック システム、個別のトレーニング プランの可能性、州の免許について説明しています。
この場合の価格は価値観の間の薄い層のようなもので、取るに足らないもののように見えるかもしれません。
到着した場合は処理させていただきます。
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さらに詳しく知る
- ゴールドスタンダードとは何ですか?なぜ直接販売でゴールドスタンダードが必要なのでしょうか? 重さ、大きさなどの基準はありますが…
挙げた例は主にマネージャーと部下の関係に関連していますが、結論は他の状況 (配偶者間のコミュニケーションなど) にも拡張できます。
多くのマネージャーは部下を批判することを恐れています
意見の交換は上司と部下の関係の主な要素ですが、多くの場合、上司は部下の仕事に対して建設的な（否定的な）評価を与えることを恐れています。 彼らは、否定的なフィードバックは従業員を怒らせ、人間関係の基礎となる信頼の原則に違反すると感じています。 原則として、そのようなリーダーは不満を内に秘めます。 彼らはさまざまな状況で沈黙し、遅刻、不適切な外見や行動（特に異性の従業員に対する）には目をつぶっています。
サンドイッチ批判の確実な利点
サンドイッチ原理は、否定的な発言やコメントを表現しやすくする人気のテクニックです。 この場合、ステートメントは「賞賛 - 批判 - 称賛」というスキームに従って構成されています。 言い換えれば、サンドイッチ原理では、ネガティブな点とポジティブな点を混ぜ合わせて議論する必要があります。
この方法の利点は次のとおりです。
- 批判を和らげ、認識しやすくします。
- 話し手が気まずい瞬間について話し合うときに、より自信を持てるようになります (たとえば、マネージャーが従業員に問題行動について話す必要がある場合、褒めることから始める方が簡単です)。
サンドイッチ原理。 例1
アンディは最近、金融コンサルティング会社に就職し、ニューヨークで 1 週間のインターンシップをオファーされました。 アンディはホテルに滞在し、毎晩ペイパービュー映画を見ました。 費用は 65 ドルで、旅費報告書に含めました。 さらに、アンディは高級レストランで食事をしました。
アンディの上司ジーンは彼の報告を受け取りました。 明らかに、映画の料金を支払うことは会社の財務計画の一部ではありませんでした。 ジーンはサンドイッチの原則を利用して支払いを拒否し、アンディに旅行でもっと賢く使うよう頼みました。
賞賛: 「アンディ、この 1 か月間でのあなたの専門的な成長には非常に感銘を受けました。 あなたはニューヨークで得た知識を積極的に活用して、顧客の財務書類を扱っているようですね。」
クリティカ: 「ところで、今朝、あなたがニューヨークから帰ってきたときに提出した報告書を見ました。 ホテルで映画に65ドルを費やしたことが記載されています。 そのような費用項目は予算に用意されていないため、私はあなたへの支払いを拒否せざるを得ません。 さらに、夕食には非常に高価な料理を注文しました。 今回は私たちが負担させていただきますが、限られた旅費を考えると、出費についてはより慎重にしていただきたいと思います。 おそらく、あなたにはまだ当社の方針を理解する時間がないでしょう。 人事担当者に、支出の許容レベルを説明した文書のコピーを渡すよう依頼しました。」
賞賛: 「しかし、ニューヨークへの旅行があなたの役に立ったことを嬉しく思います。 クライアントとのコミュニケーションに熱心に取り組んでいることに感謝します。 それを維持する！"
サンドイッチ原理。 例 2
ソフィアは、重要なプロジェクトの詳細が議論される総会を開催する責任があります。 彼女は通常、会議の前にその議題を発表することはありません。 ある会議の後、ソフィアのマネージャーはサンドイッチ原則を使って組織プロセスを改善するよう彼女に勧めました。
賞賛: 「ソフィア、会議は素晴らしかったです! すべての部門の代表者が出席し、必要な情報をすべて入手しました。 あなたは素晴らしい主催者です、ありがとう！」
批判: 「議論が時々支離滅裂になっていることに気づきましたか? 会議の前に議題を発表しないと、参加者は議題についての準備をすることができません。 彼らは書類を調べたり、書類を探しに走ったりすることを強いられます。 また、コースから逸脱して、関係のない会話に多くの時間を費やしてしまうこともよくあります。 これは避けられると思いますか? この問題については次に説明します。
褒め言葉：「よく頑張っていますね！ あなたがすべてを整理し、同僚から受け取ったデータを効果的に使用するのが得意であることが本当に気に入っています。」
結論
サンドイッチ原則により、マネージャーはコメントを言いやすく、理解しやすい方法で言い換えることができます。 良い行動を褒め、前向きな変化を促進します。
翻訳：オルガ・アイラペトヴァ
一般薬局方の記事
初めて導入されました
この一般薬局方モノグラフは、酵素結合免疫吸着検定法 (ELISA) 法に適用されます。 ELISA法は、抗原、ハプテン（不完全抗原）、抗体などの性質を持つさまざまな物質の定性・定量を行う高感度・高特異性の免疫診断法です。 ELISA 法は、ヒトや動物の感染症および非感染症の診断に広く使用されており、免疫生物学的医薬品 (IBP) の品質を確認するためにも使用できます。
この方法の原理は、抗原と抗体との特異的相互作用と免疫複合体の形成と、その後の分光光度法、化学発光およびその他の適切な技術を使用した結果として生じる複合体の検出です。 検出は、直接的（試験物質自体が酵素活性を有するか、酵素標識で標識されている場合）、または間接的または間接的（固相上に固定化された抗体に結合した試験物質が酵素標識された物質とインキュベートされた場合）のいずれかで行うことができます。抗体）。 定性分析では、「はい/いいえ」の原則に従って、研究対象の材料中の抗原または抗体の含有量に関する情報を取得できます。 定量分析を実行する場合、検量線グラフを使用して試験材料中の抗原または抗体の濃度を決定します。
一般規定
ELISA 法には 3 つの主要な段階が含まれます。1) 免疫複合体「抗原 (試験物質) - それに特異的な抗体」またはその逆の形成。 ２）コンジュゲートと、前の段階で形成された免疫複合体または遊離結合部位（決定基）との間の結合の形成。 3) 酵素タグの作用下での基質の、生化学反応の結果として記録されたシグナルへの変換。
酵素イムノアッセイを実行するすべての方法は、均一系または不均一系に分類されます。
ELISA の 3 段階すべてが溶液中で行われ、主段階の間に形成された免疫複合体を未反応成分から分離するための追加のステップが存在しない方法は、均一系 ELISA 法のグループに属します。 一般に低分子物質の測定に使用される均一系 ELISA の基礎は、酵素が抗原または抗体と結合したときに酵素の活性を阻害するプロセスです。 抗原抗体反応の結果、酵素活性が回復します。 酵素タグを含む抗原抗体免疫複合体が形成されると、酵素活性は高分子量基質に対して 95% 阻害されます。これは、酵素の活性中心から基質が立体的に排除されるためです。 抗原の濃度が増加すると、より多くの抗体が結合し、高分子量基質を加水分解できる遊離の抗原酵素結合体がより多く残ります。 均一系 ELISA 法は非常に高速です。 1 つの定義を分析するのに 1 分かかります。 この方法の感度は非常に高いです。 ピコモルレベルで物質を測定するために使用できます。
不均一法は、固体担体相と、異なる相にある未反応成分から免疫複合体を分離する必須段階（洗浄）を含む二相系での分析を特徴とします（形成された免疫複合体は固体上にあります）。相であり、未反応の錯体は溶液中にあります）。 第一段階の免疫複合体の形成が固相上で起こる不均一法は固相法と呼ばれます。
ステージ 1 (特定の複合体の形成) が溶液中で発生し、その後、固定化試薬を含む固相を使用して成分を分離する場合、メソッドは均一系 - 不均一系として分類されます。
ヘテロジニアス ELISA メソッドは、次の 3 つの主要なステップで構成されます。
- 抗原または抗体を固相に固定化し、得られる複合体を免疫吸着剤と呼びます。
- 未結合の試薬を除去し、アルブミン、カゼインなどのブロッキングタンパク質を使用して固体支持体上の結合部位をブロックします。 結合が起こるように、分析された薬物を免疫吸着剤とインキュベートします。
3) 試験物質自体の酵素活性による検出、または分析された薬物に関連する酵素標識による検出 (直接バージョン)。 場合によっては、酵素標識に結合した二次抗体と「免疫吸着剤 - 試験物質」複合体の追加のインキュベーションが実行されます (間接的なオプション)。
被検物質の定量は、使用する検出器に適した基質を添加し、被検物質のシグナルを標準サンプルと比較することにより行われます。
ヘテロジニアスELISA法は非競合ELISAと競合ELISAに分けられます。 アッセイスキームは、必要な要件に従って医薬品開発プロセス中に変更できます。 変更は薬局方モノグラフまたは規制文書に記載する必要があります。 ELISA の種類が異なれば感度も異なるため、ELISA 法の選択は被験物質の性質とその量によって決まります。 抗体を含む物質の品質を評価するには、特定の抗イディオタイプ抗体を使用できます。
非競合的ELISA法
非競合ELISA法は、検出の種類（直接競合、間接（間接）競合）と固相に固定化する物質の種類（抗原または抗体）に応じていくつかの種類に分けられます。
直接ELISAオプション
2つの方法で実行できます。 前者の場合、試験物質（抗原）は固相に直接固定化されます。 その場合、抗原に結合した標識抗体が検出器となります。 別の方法で検査を行う場合は、固相に固定化された抗体が使用されます。 この場合、検出器は酵素で標識された被検物質である。
ELISA の間接 (間接) バージョン
間接バージョンの ELISA を実行する場合、抗原は固相に固定化されます。 ブロッキング後、その抗原に特異的な抗体の溶液が抗原に添加されます。 インキュベーション後、得られた抗原抗体複合体から未結合の抗体が洗浄され、検出器として機能する酵素標識抗免疫グロブリン (抗 Ig) が添加されます。 特定の Ig クラスおよびサブクラス用の抗 Ig 検出器が市販されているため、このアッセイ形式は抗体のアイソタイピングに便利です。 さらに、標識抗 Ig の使用により、直接酵素結合免疫吸着アッセイ法と比較してシグナルが増強され、それによってアッセイの感度が向上します。
ELISA を実行するためのオプションとしての「サンドイッチ」法
最も一般的な非競争法はサンドイッチ法です。 これを実行すると、一次抗体が固相に固定化され、その後ブロックされます。 次に、抗原を含む試験物質をこれらに加えてインキュベートします。 インキュベーション後、抗原抗体複合体を未結合の抗原から洗い流し、酵素で標識した二次抗体を加えて検出を行います。
競合ELISA法
競合ELISA法は、検出の種類（直接競合、間接（間接）競合）と固相に固定化されている物質の種類（抗原または抗体）によっていくつかの種類に分けられます。
直接競合ELISA
可溶性抗原を検出または定量するには、固相上に抗原を固定化した直接競合バージョンの ELISA が使用されます。 これを行うには、適切な検出器 (西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルテニウム、フルオレセインなど) に結合した抗原特異的抗体を使用します。 標準抗原を固相に固定化し、ブロッキングします。 酵素タグに結合した抗体を試験物質（可溶性抗原）とインキュベートします。 次に、この混合物を固定化抗原に添加し、インキュベートした後、洗浄して未結合の抗原抗体複合体を除去します。 次のステップは、タグとして使用される酵素に適した基質を追加することです。 系内に 2 つの抗原が存在することによる反応の阻害は、競合する可溶性抗原を含まない対照サンプルと比較して、試験物質の量に反比例します。
直接競合固相抗体 ELISA は直接競合固相抗原 ELISA に似ていますが、抗体の検出または定量に使用されます。
間接的（間接的）競合ELISAバリアント
この ELISA 法は直接競合バージョンに似ていますが、標識抗体または抗原の代わりに、標識抗 Ig 試薬または標識二次抗体がそれぞれ検出に使用されます。
方法を実行するための一般条件エリサ
酵素免疫測定法の固相としては、シリコーン、ニトロセルロース、ポリアミド、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、アクリルなどのさまざまな材料が使用されます。 固相は、試験管の壁、96 ウェルやその他のプレート、ボール、ビーズのほか、タンパク質を積極的に吸収するニトロセルロースやその他の膜などです。 固定化の原理 (疎水性、親水性、共有結合性相互作用) は、固相の選択によって異なります。 ほとんどの場合、96 ウェルのプラスチック製マイクロタイター プレートが固相として使用されます。 プレート内のウェルの数は異なる場合があります。 タブレットは透明 (比色検出) またはマット (化学発光検出、蛍光分析) にすることができます。
固定化は、ウェル内に気泡が存在すると光学濃度の読み取り値が変化するため、気泡なしで実行する必要があります。 ビオチン化固定化試薬の使用も可能です。 この場合、反応にはストレプトアビジンとビオチン化酵素タグが使用されます。 この方法は信号を増幅するために使用されます。 固定化の時間と温度は、試薬の反応速度論的性質、安定性、濃度に応じて、薬局方モノグラフと規制文書に示されなければなりません。
酵素イムノアッセイのすべての段階、洗浄およびブロッキング溶液、各段階の時間間隔と温度条件、シェーカーでのインキュベーションの毎分回転数、検出条件も薬局方モノグラフおよび規制文書に指定する必要があります。
いくつかのタイプのELISAのメソッドの例
間接非競合ELISA法
- 抗原の吸着。薬局方モノグラフまたは規制文書に別段の記載がない限り、0.1 ～ 0.5 μg の抗原および 100 μl の 0.05 M 炭酸塩-重炭酸塩緩衝液 (pH 9.6) を 96 ウェル プレートの各ウェルに加え、次に一定温度で収着を実行します。温度 4 °C で 16 時間。pH 値の高い他の緩衝液を使用することも可能です。 インキュベーションは、水平プレートシェーカー上で振盪することによって行われる。
未結合の抗原分子の洗浄（２回）は、薬局方モノグラフまたは規制文書に別段の記載がない限り、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ９．０）（ウェル当たり３００μｌ）を用いて行われる。
- ブロッキング。抗原または抗体の非特異的結合部位をブロックするために、錠剤のウェルには、リン酸緩衝生理食塩水（pH 9.0）、または薬局方モノグラフまたは規制文書に指定されているウシ血清の 1% 溶液を含む別の緩衝液が充填されます。アルブミンまたは他のタンパク質 (カゼイン、ゼラチン、粉乳など) を加え、室温で 10 ～ 15 分間インキュベートします (薬局方モノグラフまたは規制文書に別途記載がない限り)。
Ⅲ． 特定の抗体の滴定。定量的評価が必要な場合、試験物質（抗原または抗体）は標準サンプル（RM）と並行して段階希釈で滴定されます。
滴定はプレートの水平列と垂直列の両方で実行できます。 抗体の最適濃度を選択したり、抗体の力価を決定したりする必要がある場合には、抗体の滴定が実行されることに注意してください。 抗体の最適な濃度および/または力価が決定されている場合は、これらの抗体 (血清) の推奨希釈率が使用されます。
滴定する場合、既製の抗体希釈液が一連の最初のウェルに追加されます（ウェルあたり平均 1 ～ 10 μg）。その後、ウェル内で抗体の連続希釈が行われます。 特異的抗体とのインキュベーションは、水平プレートシェーカー上で振盪しながら室温で３０分間行われる。
洗浄は、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含むｐＨ９．０のリン酸緩衝生理食塩水を用いて少なくとも３～４回行われる。
- 酵素タグに結合した抗種（抗グロブリン）抗体の追加。酵素タグに結合した抗種ポリクローナル抗体は、検出（二次）抗体として使用されます。 ほとんどの場合、分子全体または特定の抗体の Fc フラグメントに特異的なヤギまたはウサギの抗体が使用されます。 検出抗体の濃度は、通常、ストック溶液の希釈としてメーカーによって指定されます (たとえば、1:1000)。
標識二次抗体とのインキュベーションは、水平プレートシェーカー上で振盪しながら室温で３０分間実施する。
洗浄は、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ９．０）を用いて少なくとも３～４回行われる。
インキュベーションは、室温で１０分間、水平プレートシェーカー上で振とうしながら行われる。
- 100μlの基質溶液をウェルに添加し、一定に撹拌しながら室温で10分間インキュベートする。 酵素反応を停止するには、「停止試薬」が使用されます。これは、すべてのテストサンプルとコントロールサンプルに等量で添加されます。 硫酸は「停止試薬」として最もよく使用されます。
直接的な非競争性 ELISA法
直接 ELISA 法と間接的非競合 ELISA 法との違いはわずかです。 したがって、ステージ I と II は、どちらのタイプの分析でも同じです。 違いは、ELISA の直接バージョンでは、ステージ III で、酵素標識に結合された試験抗原に特異的な抗体が使用され、それらが試験物質と直接相互作用することです。 必要に応じて、非結合抗体について前述した原理と同様に、結合体の滴定を実行することもできます。 直接非競合的 ELISA のステージ IV は実行されません。
「サンドイッチ」方式 エリサ
このバージョンの ELISA では、研究対象の抗原の空間的に離れたエピトープに特異的な一対の抗体 (一次および二次) を使用します。
- 固相への抗体の吸着。抗原収着技術は、「間接的非競合 ELISA 法」セクションの抗体収着技術と同様です。
- ブロッキング。基板（固相）上の非特異的結合部位をブロックする技術は、「間接的非競合 ELISA 法」のセクションで説明したブロック技術と同様です。
Ⅲ． 抗原とのインキュベーション。薬局方モノグラフまたは規制文書に別段の指示がない限り、50μlの試験物質および抗原の標準希釈物を、予め吸着された抗体を含むプレートのウェルに添加する。 Tween-20 はタンパク質分子同士およびプレート表面への非特異的結合を減少させるため、抗原希釈液は 0.1% Tween-20 を含むリン酸緩衝生理食塩水 (pH 9.0) で調製する必要があります。 試験物質と抗原の標準希釈液の両方を、タンパク質希釈液ごとに 2 つのウェルを使用して、水平方向の列 (または 3 回反復) で隣接するウェルにペアで添加します。
インキュベーションは、一定に撹拌しながら室温で３０分間実施する。 洗浄は、0.1% Tween-20 を含むリン酸緩衝生理食塩水 (pH 9.0)、または薬局方モノグラフまたは規制文書に指定されている別の緩衝液で少なくとも 3 ～ 4 回行われます。
- 酵素タグに結合した抗体とのインキュベーション。酵素標識に結合した特異的抗体の溶液100μlをプレートのウェルに添加する。 結合抗体の最適濃度は通常、薬局方モノグラフまたは規制文書に示されています (通常、2 ～ 4 μg/ml の濃度が使用されます)。
酵素タグを含む抗体とのインキュベーションは、水平プレートシェーカー上で振盪しながら室温で30分間実施される。
洗浄は、0.1% Tween-20 を含むリン酸緩衝生理食塩水 (pH 9.0)、または薬局方モノグラフまたは規制文書に指定されている別の緩衝液を使用して、少なくとも 3 ～ 4 回行われます。
- 着色生成物の出現を伴う酵素反応の実行。酵素反応を実行するための技術は、「間接的非競合的 ELISA 法」のセクションで説明されている技術と同様です。
検出
上で述べたように、酵素タグまたは他の試薬で標識された抗体が検出に使用されます。 酵素タグは、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはガラクトシダーゼであり得る。 他の標識が付いた抗体または抗原を検出器として使用できます。 検出試薬の選択は、抗体または抗原に結合した標識の種類と検出方法によって異なります。
ラベルの選択に基づいて、分光光度法、化学発光、蛍光分析、およびその他の方法を検出方法として使用できます。
定量的ELISA法の結果
定量的 ELISA の結果は、逆回帰を伴う線形検量線から、または逆回帰を伴う非線形検量線を使用する複雑な方法によって計算されます。 結果を解釈する方法は、使用した ELISA 法によって異なります。 たとえば、検査結果を使用して、検量線を使用して未知のサンプルの濃度、最大阻害濃度の半分、または有効濃度を推定できます。 これにより、被験物質の量またはその活性を、参照/校正標準 (RM) と比較して決定することができます。 通常、分析される薬物の濃度を特徴付ける定量的 ELISA 法を実行する場合の検量線の種類は、計算された平均値に非線形に依存します。 この点に関して、さまざまな数学モデルを使用して結果の曲線を分析することをお勧めします。 他の場合には、ELISA 法は、技術の感度限界内でサンプル中の特定の試験物質の存在を評価できる定性的方法として使用されます。
注記。
炭酸塩・重炭酸塩緩衝液の調製（pH 9,6). 容量1000mlのメスシリンダーに炭酸ナトリウム（無水）1.59gまたは炭酸ナトリウム10水溶液4.29gと重曹2.93gを加え、精製水800mlに溶解し、pH9.6に調整し、混合する。次に、精製水で溶液の量をマークまでにし、再度混合します。
