(Thủy khí động lực học)
THAY ĐỔI CÁC THAM SỐ KHÍ TRONG KHI CHUYỂN TIẾP QUA NHẢY CON DẤU TRỰC TIẾP
Chúng ta hãy thiết lập mối liên hệ giữa vận tốc dòng chảy trước cú sốc và sau cú sốc. Với mục đích này, chúng ta hãy viết lại phương trình động học (xem § 10.7) dưới dạng R2 R Và і - Và2 ~ (10.64) r2i2 RShch Phương trình Bernoulli (10.15) và (10.24), áp dụng trước và sau cú sốc, cho...(Thủy khí động lực học)
Những chuyển biến mang tính cách mạng và “Đại nhảy vọt”
Cuộc cách mạng chống tư bản nước ngoài và quan liêu của Trung Quốc kéo dài 25 năm, từ 1924 đến 1949, bao gồm ba cuộc nội chiến và một cuộc chiến tranh giải phóng dân tộc chống Nhật Bản. Nó kết thúc với sự tuyên bố của Cộng hòa Nhân dân Trung Hoa vào năm 1949. Trong 25 năm, chiến tranh chưa dừng lại ở Trung Quốc...(Lịch sử kinh tế)
Tấm tường và mái bánh sandwich
Tấm bánh sandwich là một vật liệu xây dựng hiệu quả. "Bánh mì kẹp" Người ta thường gọi các kết cấu tòa nhà ở dạng các phần tử nhiều lớp nhẹ kết hợp chất lượng cách nhiệt cao với các đặc tính khác đặc trưng của kết cấu bao quanh (độ bền cơ học,...(Cơ bản về thiết kế doanh nghiệp công nghiệp nhẹ)
SỬA ĐỔI VẢI LINEN
Phương pháp biến đổi vật liệu dệt Nhân loại luôn nỗ lực tìm cách duy trì và giữ gìn sức khỏe của cơ thể. Tình trạng của da có tầm quan trọng lớn đối với sức khỏe tốt. Vì vậy, từ lâu người ta đã chú ý nhiều hơn đến vật liệu dệt...Phương pháp biến đổi vật liệu dệt
Nhân loại luôn nỗ lực tìm cách duy trì và giữ gìn sức khỏe của cơ thể. Tình trạng của da có tầm quan trọng lớn đối với sức khỏe tốt. Do đó, từ lâu người ta đã chú ý nhiều hơn đến vật liệu dệt vì chúng thường xuyên tiếp xúc với da người...(Tác dụng thích ứng của vải lanh đối với cơ thể)
Tôi đã chia sẻ bảy quy tắc quan trọng mà các nhà quản lý thành công sử dụng khi đưa ra phản hồi cho nhân viên. Trong tài liệu này, chúng ta sẽ xem xét một số mô hình cho phép bạn xây dựng một cuộc trò chuyện như vậy một cách hiệu quả. Để thuận tiện, chúng tôi sẽ sử dụng các ví dụ.
“Sandwich” phản hồi
Mô hình nổi tiếng nhất - và được sử dụng rộng rãi. Đơn giản dễ hiểu, dễ nhớ, dễ sử dụng.
Sự miêu tả: khối phản hồi phát triển nằm giữa hai khối phản hồi tích cực. Do đó có tên "bánh sandwich". Nó được sử dụng trong các cuộc trò chuyện về việc đặt mục tiêu, điều chỉnh kết quả và phát triển nhân viên. Thông thường không được sử dụng trong các cuộc trò chuyện về kỷ luật, các tình huống liên quan đến vi phạm, không hoàn thành nhiệm vụ, khi cần phải điều chỉnh hành vi của nhân viên.
Tình huống: Sergey, nhân viên bộ phận bán hàng, đã hoàn thành kế hoạch theo hai chỉ số (số lượng bán hàng và số lượng khách hàng đang hoạt động). Tuy nhiên, mục tiêu bán sản phẩm mới chỉ đạt được 50%.
Ví dụ:
Bắt đầu với một đánh giá tích cực.
“Sergey, thật vui khi biết rằng tháng này bạn đã được đưa vào nhóm những người bán hàng tốt nhất đã hoàn thành 100% kế hoạch doanh số bán hàng. Tôi thấy bạn đã phải làm việc chăm chỉ và thiết lập mối quan hệ với nhiều khách hàng - bạn cũng là người dẫn đầu về số lượng khách hàng đang hoạt động.” Sau những lời động viên như vậy, nhân viên sẽ sẵn sàng thảo luận về những lĩnh vực công việc cần cải thiện.
Thảo luận về những gì cần cải thiện và thay đổi, đồng thời thống nhất kế hoạch hành động.
“Đồng thời, vẫn còn chỗ để phát triển. Hãy chú ý đến việc bán thương hiệu mới. Tháng này bạn chỉ hoàn thành được một nửa những gì bạn dự định. Điều quan trọng hiện nay đối với công ty là đưa sản phẩm này ra thị trường. Hãy cùng thảo luận xem bạn có thể làm gì để cải thiện chỉ số này vào tháng tới.” Lưu ý rằng không có lời chỉ trích. Có đối thoại và thảo luận mang tính xây dựng.
Kết thúc cuộc trò chuyện bằng một ghi chú tích cực. “Tuyệt vời, kế hoạch đã được thống nhất, giờ hãy hành động thôi. Tôi chắc chắn rằng với khả năng làm việc với khách hàng của bạn, bạn có thể giải quyết được nhiệm vụ này. Hãy nhớ rằng: nếu bạn tăng doanh số bán hàng của một thương hiệu mới, bạn có thể lọt vào top ba người chiến thắng trong cuộc thi hiện đang diễn ra. Nếu cần giúp đỡ thì vào đi."
B.O.F.F.
Sự miêu tả: viết tắt của các chữ cái đầu trong tên tiếng Anh của bốn giai đoạn của mô hình. Hành vi (Behaviour) - Kết quả (Outcome) - Cảm giác (Feelings) - Tương lai (Tương lai).
Tình huống: Một nhân viên mới của bộ phận dịch vụ khách hàng, Irina, thường xuyên vi phạm các tiêu chuẩn về chất lượng dịch vụ, cụ thể là: cô ấy không chào đón khách hàng, thô lỗ, phớt lờ yêu cầu của khách hàng, không trả lời điện thoại và đến muộn trong giờ nghỉ trưa.
Ví dụ:
Hành vi.
Hãy cho Irina biết những quan sát của bạn về công việc của cô ấy. Cụ thể, bằng ngôn ngữ của sự kiện, tốt nhất là có chi tiết, ngày tháng quan sát. Thảo luận về lý do. Đôi khi xảy ra trường hợp nhân viên không nhận thức đầy đủ về những gì được mong đợi ở mình.
Kết quả.
Thảo luận với Irina về hành vi của cô ấy (khó chịu và thô lỗ khi làm việc với khách hàng, phớt lờ yêu cầu, nghỉ làm lâu sau khi nghỉ giải lao) ảnh hưởng đến kết quả kinh doanh, số lượng khiếu nại từ khách hàng và số lượng Khách hàng được phục vụ.
Cảm xúc.
Nói về cảm giác của bạn khi biết Irina làm việc theo cách này. Bạn buồn, buồn, không vui lắm, bạn khó chịu khi nhận ra điều đó. Thảo luận về cảm giác của các nhân viên khác khi Irina vắng nhà trong thời gian dài và họ phải làm việc với khối lượng công việc tăng thêm. Bằng cách này, bạn sẽ giúp Irina nhận ra rằng hành vi của cô ấy là không thể chấp nhận được.
Tương lai. Thảo luận với Irina xem cô ấy có thể làm gì trong tương lai để loại bỏ hành vi này. Tốt nhất là hãy đặt câu hỏi và nhận được câu trả lời từ nhân viên. Điều này sẽ cho phép cô ấy chịu trách nhiệm về các quyết định và hành động trong tương lai. Khi kết thúc cuộc trò chuyện, hãy thống nhất về các hành động và thời hạn cụ thể - vạch ra kế hoạch hành động cho tương lai. Và rất nên sắp xếp một ngày gặp mặt để bạn sẽ tự mình tóm tắt công việc mà Irina sẽ làm.
Sự miêu tả: Tiêu chuẩn - Quan sát - Kết quả.
Tình huống: Andrey, nhân viên của trung tâm hỗ trợ kỹ thuật, đã không trả lời yêu cầu khắc phục sự cố từ bộ phận phát triển kinh doanh.
Ví dụ:
Tiêu chuẩn.
Nhắc lại những tiêu chuẩn đã được đặt ra. “Trong năm thứ hai, bộ phận của chúng tôi đã có tiêu chuẩn phản hồi nhanh - mọi yêu cầu phải được trả lời trong vòng 15 phút. Điều này không có nghĩa là lỗi nhất thiết sẽ được khắc phục trong 15 phút này, nhưng khách hàng của chúng tôi sẽ nhận được phản hồi rằng ứng dụng đã được chấp nhận và chúng tôi đã bắt đầu làm việc ”.
Quan sát.
Nêu các sự kiện và quan sát. “Trên đơn đăng ký mà bạn nhận được lúc 10:25 ngày hôm qua từ bộ phận phát triển kinh doanh, khách hàng đã không nhận được phản hồi cho đến đầu ngày hôm nay. Vấn đề vẫn chưa được giải quyết: vẫn không có quyền truy cập vào hệ thống.”
Kết quả. Thảo luận về tác động của hành vi đối với doanh nghiệp, nhóm, khách hàng, nhân viên. “Kết quả là bộ phận phát triển kinh doanh buộc phải hoãn đàm phán với một khách hàng lớn ngày hôm qua; họ không thể có được thông tin cần thiết để chuẩn bị. Đây là một khách hàng quan trọng của công ty và chúng tôi không có gì đảm bảo rằng họ sẽ không bắt đầu đàm phán với các đối thủ cạnh tranh do sự chậm chạp của chúng tôi ”.
Điều hợp lý là bước tiếp theo là nhân viên phải cam kết thay đổi hành vi của chính mình.
Sự miêu tả: Thành Công – Bài Học (Learn) – Thay Đổi (Changes). Mô hình phản hồi này rất phù hợp với làm việc nhóm: công việc của nhóm dự án khi tổng kết kết quả cuối cùng hoặc trung gian, họp nhóm.
Tình huống: Nhóm dự án đã hoàn thành giai đoạn phát triển đầu tiên của hệ thống mới.
Ví dụ:
Yêu cầu mỗi thành viên trong nhóm dự án liệt kê 2 thành tựu cá nhân quan trọng nhất mà họ đạt được trong dự án, 1 bài học quan trọng nhất họ đã học được và 1 thay đổi họ cần thực hiện trong giai đoạn thứ hai của dự án. Vậy thì hãy để mọi người có tiếng nói của mình. Lập danh sách và chọn ra 5 thành tựu quan trọng nhất, 2 bài học và 1 thay đổi quan trọng nhất. Số lượng mục trong danh sách có thể thay đổi tùy theo tình hình và quy mô của nhóm dự án.
Tất nhiên, có nhiều cách khác để tổ chức cuộc trò chuyện với nhân viên. Bài viết này cung cấp cái nhìn tổng quan về các mô hình phản hồi được biết đến và sử dụng thành công nhất trong thực tế.
Khách hàng mua sản phẩm khi giá trị của nó cao hơn giá bán. Có giá trị thì có lãi. Và trong trường hợp này, giá là thước đo để xác định nhu cầu về một sản phẩm.
Bạn nêu giá, họ nói "cảm ơn, tôi sẽ suy nghĩ về việc đó." Nhưng nếu bạn thêm đủ lợi ích vào ưu đãi, giá trị sẽ lớn hơn giá cả.
Phương pháp bánh sandwich trong bán hàng
Trong trường hợp này, giá giống như bơ, “trải” các giá trị thành một lớp mỏng. Đây là phương pháp bánh sandwich trong bán hàng.
Kỹ thuật này được sử dụng trong hai phiên bản. Ví dụ: chúng tôi đặt tên cho giá và sau đó cho biết giá này bao gồm những gì:
“Giá của sản phẩm là XXX. Giá này bao gồm chính thiết bị và một bộ phụ tùng thay thế. Ngoài ra chúng tôi còn miễn phí vận chuyển và lắp đặt. Bảo hành theo ưu đãi của chúng tôi không phải là một năm, như trong hầu hết các trường hợp đối với các sản phẩm tương tự, mà là ba năm.”
Hoặc ngược lại - trước tiên chúng ta nói về ưu điểm và “để dành” giá cho sau này. Ví dụ: một công ty nổi tiếng cung cấp các khóa học dành cho các chuyên gia về web. Trên trang danh thiếp, lời đề nghị rất chi tiết - mức thu nhập cao dành cho các chuyên gia có sẵn và nhu cầu cao của họ, một bộ kỹ năng sẽ hữu ích trong nhiều ngành, thời gian đào tạo ngắn và thực tập tại các công ty lớn. Mô tả nói rằng để thành thạo khóa học, tất cả những gì bạn cần là mong muốn. Quá trình học rất đơn giản - tất cả những gì bạn cần là kết nối Internet. Một bộ phận đáng kể sinh viên tìm thấy cơ hội để nhận ra tiềm năng của mình trong lĩnh vực này trong quá trình học tập. Phản hồi từ những người dùng đã hoàn thành khóa đào tạo cũng được cung cấp.
Ở cuối trang - danh thiếp một lần nữa được tóm tắt dưới dạng danh sách tất cả các ưu điểm, số lượng vị trí còn lại. Và ngay trước khi nộp đơn đăng ký, giá đã được đưa ra - khóa học hóa ra không miễn phí. Nhưng cho đến khi người dùng quan tâm đến mức giá, anh ta mới có cơ hội làm quen với tất cả những ưu điểm.
Phương pháp bánh sandwich trong bán hàng
Phương pháp bán hàng theo kiểu bánh sandwich có vẻ hơi khác một chút - chúng tôi “đặt” giá vào giữa ưu đãi. Đầu tiên chúng ta nói về “lợi ích” - ưu điểm, đặt tên cho giá cả và cuối cùng chúng ta bổ sung thêm nhiều lợi ích hơn. Tính toán tác động tâm lý - nếu có nhiều đối số thì đối số đầu tiên và cuối cùng sẽ được ghi nhớ. Những lập luận ở giữa sẽ “làm mất đi” sự chú ý của khách hàng.
Phương pháp bánh sandwich có thể trông như thế nào trong thực tế:
Ví dụ trên là về việc cung cấp một khóa học trực tuyến, sau khi giá được công bố, một số “quà tặng” khác sẽ được thêm vào. Ví dụ, nó nói về những giáo viên có trình độ cao, một hệ thống phản hồi được phát triển, khả năng có kế hoạch đào tạo cá nhân và giấy phép của tiểu bang.
Giá trong trường hợp này giống như một lớp mỏng giữa các giá trị và có thể trông giống như một thứ gì đó không đáng kể.
Nếu nó đến, chúng tôi sẽ xử lý nó.
Chia sẻ trên mạng xã hội
Tìm hiểu nhiều hơn nữa
- Tiêu chuẩn vàng là gì và tại sao nó lại cần thiết trong bán hàng trực tiếp? Có tiêu chuẩn về trọng lượng, kích thước...
Các ví dụ được đưa ra chủ yếu liên quan đến mối quan hệ giữa người quản lý và cấp dưới, nhưng kết luận có thể được mở rộng sang các tình huống khác (ví dụ: giao tiếp giữa vợ chồng).
Nhiều nhà quản lý ngại chỉ trích cấp dưới
Trao đổi ý kiến là thành phần chính trong mối quan hệ giữa người quản lý và cấp dưới, nhưng các nhà quản lý thường ngại đưa ra đánh giá mang tính xây dựng (tiêu cực) về công việc của cấp dưới. Họ cảm thấy rằng những phản hồi tiêu cực sẽ xúc phạm nhân viên và vi phạm nguyên tắc tin cậy làm nền tảng cho mối quan hệ. Theo quy luật, những nhà lãnh đạo như vậy sẽ giữ sự bất mãn trong lòng. Họ im lặng trong nhiều tình huống, nhắm mắt làm ngơ trước sự đi trễ, ngoại hình và hành vi không phù hợp (đặc biệt là đối với nhân viên khác giới).
Lợi ích được đảm bảo của việc phê bình Sandwich
Nguyên tắc bánh sandwich là một kỹ thuật phổ biến giúp bạn dễ dàng bày tỏ những nhận xét và nhận xét tiêu cực hơn. Trong trường hợp này, câu phát biểu được cấu trúc theo sơ đồ “khen - phê bình - khen ngợi”. Nói cách khác, nguyên tắc bánh sandwich liên quan đến việc thảo luận những điểm tiêu cực xen lẫn những điểm tích cực.
Ưu điểm của phương pháp này là nó:
- Làm dịu đi những lời chỉ trích và làm cho nó dễ nhận biết hơn.
- Cho phép người nói cảm thấy tự tin hơn khi thảo luận về những khoảnh khắc khó xử (ví dụ: nếu người quản lý cần nói với nhân viên về các vấn đề về hành vi, anh ta sẽ dễ dàng bắt đầu bằng lời khen ngợi hơn).
Nguyên tắc bánh sandwich. ví dụ 1
Andy gần đây đã nhận việc tại một công ty tư vấn tài chính và được mời thực tập một tuần ở New York. Andy ở khách sạn và xem phim trả tiền mỗi tối. Anh ấy phải trả 65 đô la, số tiền này được anh ấy đưa vào báo cáo chi phí chuyến đi của mình. Ngoài ra, Andy còn ăn tối ở những nhà hàng đắt tiền.
Ông chủ Jean của Andy đã nhận được báo cáo của anh ấy. Rõ ràng, việc trả tiền mua phim không nằm trong kế hoạch tài chính của công ty. Jean đã sử dụng nguyên tắc bánh sandwich để từ chối thanh toán và yêu cầu Andy chi tiêu khôn ngoan hơn cho các chuyến đi của mình.
Lời khen: “Andy, tôi rất ấn tượng với sự phát triển nghề nghiệp của bạn trong tháng qua. Tôi thấy rằng bạn đang tích cực sử dụng kiến thức thu được ở New York để làm việc với tài liệu tài chính của khách hàng.”
Kritika: “Nhân tiện, sáng nay tôi đã xem báo cáo mà bạn đã nộp khi trở về từ New York. Nó nói rằng bạn đã chi 65 USD cho việc xem phim tại khách sạn. Tôi buộc phải từ chối thanh toán cho bạn vì khoản chi phí đó không được cung cấp trong ngân sách của chúng tôi. Ngoài ra, bạn đã gọi những món ăn rất đắt tiền cho bữa tối. Lần này chúng tôi sẽ trả tiền cho họ, nhưng do ngân sách đi lại có hạn, tôi yêu cầu bạn cẩn thận hơn trong chi tiêu của mình. Rất có thể, bạn chưa có thời gian để làm quen với chính sách của công ty chúng tôi. Tôi đã yêu cầu đại diện nhân sự đưa cho anh một bản sao tài liệu mô tả mức chi tiêu có thể chấp nhận được."
Khen ngợi: “Nhưng tôi rất vui vì chuyến đi tới New York đã giúp ích cho bạn. Tôi đánh giá cao sự chăm chỉ và siêng năng của bạn trong việc giao tiếp với khách hàng. Hãy tiếp tục nhé!"
Nguyên tắc bánh sandwich. Ví dụ 2
Sofia chịu trách nhiệm tổ chức các cuộc họp chung để thảo luận chi tiết về các dự án quan trọng. Cô ấy thường không bao giờ thông báo chủ đề trước cuộc họp. Sau một cuộc họp, người quản lý của Sophia đã sử dụng nguyên tắc bánh sandwich để khuyến khích cô cải thiện quy trình tổ chức.
Khen ngợi: “Sofia, cuộc gặp gỡ thật tuyệt vời! Đại diện của tất cả các phòng ban đã tham dự và chúng tôi đã nhận được tất cả các thông tin cần thiết. Bạn là một nhà tổ chức tuyệt vời, cảm ơn bạn!
Chỉ trích: “Bạn có để ý rằng đôi khi cuộc thảo luận bị rời rạc không? Nếu bạn không thông báo chủ đề trước cuộc họp, những người tham gia sẽ không thể chuẩn bị được. Họ buộc phải lục lọi giấy tờ, chạy tìm tài liệu, v.v. Ngoài ra, chúng ta thường đi chệch hướng và dành nhiều thời gian cho những cuộc trò chuyện không liên quan. Bạn có nghĩ rằng điều này có thể tránh được? Sau đây là một cuộc thảo luận về vấn đề này.
Khen ngợi: “Bạn đang làm rất tốt! Tôi thực sự thích rằng bạn rất giỏi trong việc sắp xếp mọi thứ và sử dụng hiệu quả dữ liệu nhận được từ đồng nghiệp của mình.”
Phần kết luận
Nguyên tắc bánh sandwich cho phép người quản lý diễn đạt lại nhận xét theo cách dễ nói và dễ hiểu hơn. Nó khen thưởng hành vi tốt và thúc đẩy sự thay đổi tích cực.
Bản dịch của Olga Airapetova
BÀI VIẾT DƯỢC PHẨM TỔNG QUÁT
Được giới thiệu lần đầu tiên
Chuyên khảo dược điển chung này áp dụng cho phương pháp xét nghiệm miễn dịch hấp thụ liên kết với enzyme (ELISA). Phương pháp ELISA là một phương pháp chẩn đoán miễn dịch có độ nhạy cao và đặc hiệu cao, được sử dụng để tiến hành xác định định tính và định lượng các chất khác nhau có đặc tính của kháng nguyên, hapten (kháng nguyên không đầy đủ) hoặc kháng thể. Phương pháp ELISA được sử dụng rộng rãi để chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm và không truyền nhiễm ở người và động vật, đồng thời cũng có thể được sử dụng để xác nhận chất lượng của các sản phẩm thuốc sinh học miễn dịch (IBP).
Nguyên lý của phương pháp này là sự tương tác đặc hiệu của kháng nguyên với kháng thể với sự hình thành phức hợp miễn dịch và sau đó phát hiện phức hợp thu được bằng phương pháp đo quang phổ, phát quang hóa học và các kỹ thuật thích hợp khác. Việc phát hiện có thể là trực tiếp (khi bản thân chất thử có hoạt tính enzyme hoặc được dán nhãn enzyme) hoặc gián tiếp hoặc gián tiếp (khi chất thử, liên kết với kháng thể cố định trên pha rắn, được ủ với chất đánh dấu enzyme). kháng thể). Phân tích định tính cho phép bạn thu được thông tin về hàm lượng kháng nguyên hoặc kháng thể trong vật liệu đang nghiên cứu theo nguyên tắc “có/”không”. Khi tiến hành phân tích định lượng, nồng độ kháng nguyên hoặc kháng thể trong vật liệu xét nghiệm được xác định bằng biểu đồ hiệu chuẩn.
CÁC QUY ĐỊNH CHUNG
Phương pháp ELISA bao gồm 3 giai đoạn chính: 1) hình thành phức hợp miễn dịch “kháng nguyên (chất xét nghiệm) – kháng thể đặc hiệu với nó” hoặc ngược lại; 2) sự hình thành liên kết giữa liên hợp và phức hợp miễn dịch được hình thành ở giai đoạn trước hoặc với các vị trí liên kết tự do (các yếu tố quyết định); 3) sự biến đổi cơ chất dưới tác động của thẻ enzyme thành tín hiệu được ghi lại do phản ứng sinh hóa.
Tất cả các phương pháp thực hiện xét nghiệm miễn dịch enzyme được phân loại là đồng nhất hoặc không đồng nhất.
Các phương pháp trong đó cả 3 giai đoạn ELISA đều diễn ra trong dung dịch và giữa các giai đoạn chính không có bước bổ sung để tách các phức hợp miễn dịch hình thành khỏi các thành phần không phản ứng, thuộc nhóm phương pháp ELISA đồng nhất. Cơ sở của ELISA đồng nhất, thường được sử dụng để xác định các chất có phân tử thấp, là quá trình ức chế hoạt động của enzyme khi nó kết hợp với kháng nguyên hoặc kháng thể. Kết quả của phản ứng kháng nguyên-kháng thể là hoạt động của enzyme được phục hồi. Khi phức hợp miễn dịch kháng nguyên-kháng thể chứa thẻ enzyme được hình thành, hoạt động của enzyme bị ức chế 95% so với cơ chất có trọng lượng phân tử cao, điều này là do sự loại trừ không gian của cơ chất khỏi trung tâm hoạt động của enzyme. Khi nồng độ kháng nguyên tăng lên, ngày càng có nhiều kháng thể liên kết và ngày càng có nhiều liên hợp enzyme kháng nguyên tự do tồn tại, có khả năng thủy phân cơ chất có trọng lượng phân tử cao. Phương pháp ELISA đồng nhất rất nhanh. Phải mất 1 phút để phân tích một định nghĩa. Độ nhạy của phương pháp khá cao. Nó có thể được sử dụng để xác định một chất ở mức độ picomol.
Các phương pháp không đồng nhất được đặc trưng bằng cách phân tích trong hệ thống hai pha với sự tham gia của pha chất rắn và giai đoạn bắt buộc là tách các phức hợp miễn dịch khỏi các thành phần không phản ứng (rửa), ở các pha khác nhau (các phức hợp miễn dịch được hình thành nằm trên chất rắn). pha và các phức không phản ứng ở trong dung dịch). Các phương pháp không đồng nhất trong đó sự hình thành phức hợp miễn dịch ở giai đoạn đầu xảy ra trên pha rắn được gọi là phương pháp pha rắn.
Các phương pháp được phân loại là đồng nhất-không đồng nhất nếu giai đoạn 1 - sự hình thành các phức chất cụ thể - xảy ra trong dung dịch, sau đó sử dụng pha rắn với thuốc thử cố định để tách các thành phần.
Phương pháp ELISA không đồng nhất bao gồm 3 bước chính:
- cố định kháng nguyên hoặc kháng thể trên pha rắn, phức hợp thu được được gọi là chất hấp thụ miễn dịch;
- loại bỏ thuốc thử không liên kết và chặn các vị trí liên kết trên giá đỡ vững chắc bằng cách sử dụng các protein chặn, chẳng hạn như albumin, casein; ủ thuốc được phân tích bằng chất hấp thụ miễn dịch để xảy ra sự gắn kết của chúng;
3) phát hiện do hoạt động enzym của chính chất thử hoặc do nhãn enzym liên quan đến thuốc được phân tích (phiên bản trực tiếp). Trong một số trường hợp, tiến hành ủ thêm phức hợp “chất thử nghiệm hấp thụ miễn dịch” với các kháng thể thứ cấp được liên hợp với nhãn enzym (tùy chọn gián tiếp).
Việc xác định định lượng chất thử được thực hiện bằng cách thêm chất nền phù hợp với máy dò được sử dụng và so sánh tín hiệu của chất thử với mẫu chuẩn.
Phương pháp ELISA không đồng nhất được chia thành ELISA không cạnh tranh và ELISA cạnh tranh. Sơ đồ khảo nghiệm có thể được sửa đổi trong quá trình phát triển thuốc phù hợp với các yêu cầu cần thiết. Những thay đổi phải được nêu trong chuyên khảo dược điển hoặc tài liệu quy định. Việc lựa chọn phương pháp ELISA phụ thuộc vào bản chất của chất thử và số lượng của nó, vì các loại ELISA khác nhau có độ nhạy khác nhau. Để đánh giá chất lượng của các chất chứa kháng thể, có thể sử dụng kháng thể kháng nguyên đặc hiệu.
Phương pháp ELISA không cạnh tranh
Phương pháp ELISA không cạnh tranh được chia thành nhiều loại theo loại phát hiện (cạnh tranh trực tiếp, cạnh tranh gián tiếp (gián tiếp)) và theo loại chất cố định trên pha rắn (kháng nguyên hoặc kháng thể).
Tùy chọn ELISA trực tiếp
Có thể thực hiện theo 2 cách. Trong trường hợp đầu tiên, chất thử nghiệm (kháng nguyên) được cố định trực tiếp trên pha rắn; khi đó kháng thể được đánh dấu liên kết với kháng nguyên là máy dò. Khi thực hiện xét nghiệm theo cách khác, kháng thể cố định trên pha rắn sẽ được sử dụng. Trong trường hợp này, máy dò là chất thử được đánh dấu bằng enzyme.
Phiên bản gián tiếp (gián tiếp) của ELISA
Khi thực hiện phiên bản ELISA gián tiếp, kháng nguyên được cố định trên pha rắn. Sau khi ngăn chặn, dung dịch kháng thể đặc hiệu với nó sẽ được thêm vào kháng nguyên. Sau khi ủ, phức hợp kháng nguyên-kháng thể thu được sẽ được rửa sạch khỏi các kháng thể không liên kết và kháng globulin miễn dịch được đánh dấu bằng enzyme (kháng Ig) được thêm vào, hoạt động như một máy dò. Máy dò kháng Ig hiện có sẵn trên thị trường cho các lớp và phân lớp Ig cụ thể, làm cho định dạng xét nghiệm này trở nên thuận tiện cho việc tạo mẫu kháng thể. Ngoài ra, việc sử dụng kháng thể Ig được dán nhãn giúp tăng cường tín hiệu so với phương pháp xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết trực tiếp với enzyme, do đó làm tăng độ nhạy của xét nghiệm.
Phương pháp “sandwich” là một lựa chọn để thực hiện ELISA
Phương pháp không cạnh tranh phổ biến nhất là phương pháp sandwich. Khi nó được thực hiện, các kháng thể sơ cấp sẽ được cố định trên pha rắn và sau đó bị chặn lại. Sau đó, chất thử chứa kháng nguyên được thêm vào chúng và ủ. Sau khi ủ, phức hợp kháng nguyên-kháng thể được rửa sạch khỏi kháng nguyên không liên kết và các kháng thể thứ cấp được đánh dấu bằng enzyme được thêm vào và tiến hành phát hiện.
Phương pháp ELISA cạnh tranh
Phương pháp ELISA cạnh tranh được chia thành nhiều loại: theo loại phát hiện (cạnh tranh trực tiếp, cạnh tranh gián tiếp (gián tiếp)) và theo loại chất cố định trên pha rắn (kháng nguyên hoặc kháng thể).
ELISA cạnh tranh trực tiếp
Để phát hiện hoặc định lượng các kháng nguyên hòa tan, người ta sử dụng phiên bản ELISA cạnh tranh trực tiếp với kháng nguyên cố định trên pha rắn. Để làm điều này, sử dụng kháng thể đặc hiệu của kháng nguyên được liên hợp với máy dò thích hợp (ví dụ, peroxidase cải ngựa, phosphatase kiềm, ruthenium hoặc fluorescein). Một kháng nguyên tiêu chuẩn được cố định vào pha rắn, sau đó được phong bế. Kháng thể được liên hợp với thẻ enzyme được ủ với chất thử nghiệm (kháng nguyên hòa tan). Hỗn hợp này sau đó được thêm vào kháng nguyên cố định, ủ và rửa sạch để loại bỏ phức hợp kháng nguyên-kháng thể không liên kết. Bước tiếp theo là thêm chất nền phù hợp cho enzyme đang được sử dụng làm thẻ. Sự ức chế phản ứng do có mặt 2 kháng nguyên trong hệ thống so với mẫu đối chứng không có kháng nguyên hòa tan cạnh tranh tỷ lệ nghịch với lượng chất thử.
ELISA kháng thể pha rắn cạnh tranh trực tiếp tương tự như ELISA kháng nguyên rắn cạnh tranh trực tiếp, nhưng được sử dụng để phát hiện hoặc định lượng kháng thể.
Biến thể ELISA cạnh tranh gián tiếp (gián tiếp)
Phương pháp ELISA này tương tự như phương pháp cạnh tranh trực tiếp, nhưng thay vì sử dụng kháng thể hoặc kháng nguyên được đánh dấu, thuốc thử kháng Ig được đánh dấu hoặc kháng thể thứ cấp được đánh dấu sẽ được sử dụng tương ứng để phát hiện.
Điều kiện chung để thực hiện phương phápELISA
Các vật liệu khác nhau được sử dụng làm pha rắn cho xét nghiệm miễn dịch enzyme: silicone, nitrocellulose, polyamit, polystyrene, polyvinyl clorua, polypropylen, acrylic và các loại khác. Pha rắn có thể là thành ống nghiệm, 96 giếng và các đĩa, quả bóng, hạt khác, cũng như nitrocellulose và các màng khác hấp thụ tích cực protein. Nguyên lý cố định (tương tác kỵ nước, ưa nước, cộng hóa trị) phụ thuộc vào việc lựa chọn pha rắn. Thông thường, các tấm microtiter nhựa 96 giếng được sử dụng làm pha rắn. Số lượng giếng trong tấm có thể khác nhau. Máy tính bảng có thể trong suốt (phát hiện đo màu) hoặc mờ (phát quang hóa học, đo huỳnh quang).
Việc cố định phải được thực hiện mà không có bọt khí trong giếng, vì sự hiện diện của chúng làm thay đổi kết quả đo mật độ quang. Có thể sử dụng thuốc thử cố định biotatin hóa. Trong trường hợp này, phản ứng sử dụng streptavidin và thẻ enzyme biotatin hóa. Phương pháp này được sử dụng để khuếch đại tín hiệu. Thời gian và nhiệt độ cố định, tùy thuộc vào bản chất động học, độ ổn định và nồng độ của thuốc thử, phải được nêu trong chuyên khảo dược điển và tài liệu quy định.
Tất cả các giai đoạn của xét nghiệm miễn dịch enzyme, dung dịch rửa và ngăn chặn, khoảng thời gian và điều kiện nhiệt độ cho từng giai đoạn, số vòng quay mỗi phút để ủ trên máy lắc, điều kiện phát hiện cũng phải được quy định trong chuyên khảo dược điển và tài liệu quy định.
Ví dụ về phương pháp đối với một số loại ELISA
Phương pháp ELISA gián tiếp không cạnh tranh
- Hấp thụ kháng nguyên. Thêm 0,1-0,5 μg kháng nguyên và 100 μl dung dịch đệm cacbonat-bicarbonate 0,05 M (pH 9,6) vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng, trừ khi có quy định khác trong chuyên khảo dược điển hoặc tài liệu quy định, sau đó tiến hành hấp phụ ở nhiệt độ nhiệt độ 4°C trong 16 giờ, có thể sử dụng các dung dịch đệm khác có giá trị pH cao. Quá trình ủ được thực hiện bằng cách lắc trên máy lắc đĩa nằm ngang.
Việc rửa (hai lần) các phân tử kháng nguyên không liên kết được thực hiện bằng dung dịch muối đệm phốt phát (pH 9,0) chứa 0,1% Tween-20 (300 μl mỗi giếng), trừ khi có chỉ định khác trong chuyên khảo dược điển hoặc tài liệu quy định.
- Chặn.Để chặn các vị trí liên kết không đặc hiệu của kháng nguyên hoặc kháng thể, các giếng của viên thuốc được đổ đầy dung dịch muối đệm phốt phát (pH 9,0) hoặc dung dịch đệm khác được chỉ định trong chuyên khảo dược điển hoặc trong tài liệu quy định có chứa dung dịch huyết thanh bò 1% albumin hoặc các protein khác (casein, gelatin, sữa bột, v.v.) và ủ trong 10–15 phút ở nhiệt độ phòng (trừ khi có chỉ định khác trong chuyên khảo dược điển hoặc tài liệu quy định).
III. Chuẩn độ kháng thể đặc hiệu. Nếu cần đánh giá định lượng, chất thử (kháng nguyên hoặc kháng thể) được chuẩn độ theo các độ pha loãng nối tiếp song song với mẫu chuẩn (RM).
Việc chuẩn độ có thể được thực hiện theo cả hàng ngang và hàng dọc của tấm. Cần lưu ý rằng việc chuẩn độ kháng thể được thực hiện nếu cần chọn nồng độ kháng thể tối ưu hoặc xác định hiệu giá của chúng. Nếu xác định được nồng độ và/hoặc hiệu giá tối ưu của kháng thể thì nên sử dụng độ pha loãng được khuyến nghị cho các kháng thể này (huyết thanh).
Khi chuẩn độ, dung dịch pha loãng kháng thể làm sẵn được thêm vào giếng đầu tiên của dãy - trung bình 1-10 μg mỗi giếng, sau đó tiến hành pha loãng tuần tự các kháng thể trong giếng. Việc ủ với các kháng thể đặc hiệu được thực hiện trong 30 phút ở nhiệt độ phòng bằng cách lắc trên máy lắc đĩa ngang.
Việc rửa được thực hiện ít nhất 3-4 lần bằng dung dịch muối đệm phốt phát pH 9,0 chứa 0,1% Tween-20.
- Bổ sung các kháng thể kháng loài (antiglobulin) được liên hợp vào thẻ enzyme. Các kháng thể đa dòng kháng loài được kết hợp với thẻ enzyme được sử dụng làm kháng thể phát hiện (thứ cấp). Thông thường, kháng thể dê hoặc thỏ được sử dụng, đặc hiệu cho toàn bộ phân tử hoặc các đoạn Fc của kháng thể cụ thể. Nồng độ của kháng thể phát hiện thường được nhà sản xuất quy định là độ pha loãng của dung dịch gốc (ví dụ: 1:1000).
Việc ủ với các kháng thể thứ cấp được đánh dấu được thực hiện trong 30 phút ở nhiệt độ phòng bằng cách lắc trên máy lắc đĩa ngang.
Việc rửa được thực hiện ít nhất 3-4 lần bằng dung dịch muối đệm phốt phát (pH 9,0) chứa 0,1% Tween-20.
Việc ủ được thực hiện trong 10 phút ở nhiệt độ phòng và lắc trên máy lắc đĩa ngang.
- 100 µl dung dịch cơ chất được thêm vào các giếng và ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng và khuấy liên tục. Để dừng phản ứng enzyme, người ta sử dụng “thuốc thử dừng” được thêm vào tất cả các mẫu thử nghiệm và mẫu đối chứng với số lượng bằng nhau. Axit sulfuric thường được sử dụng làm “thuốc thử dừng”.
Trực tiếp không cạnh tranh Phương pháp ELISA
Phương pháp ELISA trực tiếp chỉ có một chút khác biệt so với phương pháp ELISA gián tiếp không cạnh tranh. Vì vậy, giai đoạn I và II đều giống nhau trong cả hai loại phân tích. Sự khác biệt là trong phiên bản ELISA trực tiếp, ở giai đoạn III, các kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên xét nghiệm được sử dụng, liên hợp với nhãn enzyme và chúng tương tác trực tiếp với chất thử nghiệm. Nếu cần, việc chuẩn độ các chất liên hợp cũng có thể được tiến hành tương tự như nguyên tắc được mô tả trước đây đối với các kháng thể không liên hợp. Giai đoạn IV của ELISA không cạnh tranh trực tiếp không được thực hiện.
Phương pháp "bánh sandwich" ELISA
Phiên bản ELISA này sử dụng một cặp kháng thể (sơ cấp và thứ cấp) đặc hiệu cho các epitop ở khoảng cách xa của kháng nguyên đang được nghiên cứu.
- Hấp phụ kháng thể trên pha rắn. Kỹ thuật hấp phụ kháng nguyên tương tự như kỹ thuật hấp phụ kháng thể ở phần “Phương pháp ELISA gián tiếp không cạnh tranh”.
- Chặn. Kỹ thuật chặn các vị trí liên kết không đặc hiệu trên chất nền (pha rắn) tương tự như kỹ thuật chặn được mô tả trong phần “Phương pháp ELISA gián tiếp không cạnh tranh”.
III. Ủ bằng kháng nguyên. 50 µl chất thử và các dung dịch pha loãng chuẩn của kháng nguyên được thêm vào các giếng của đĩa có kháng thể đã được hấp phụ trước, trừ khi có chỉ định khác trong chuyên khảo dược điển hoặc tài liệu quy định. Dung dịch pha loãng kháng nguyên nên được chuẩn bị trong dung dịch muối đệm phốt phát (pH 9,0) chứa 0,1% Tween-20, vì Tween-20 làm giảm sự liên kết không đặc hiệu của các phân tử protein với nhau và với bề mặt đĩa. Cả chất thử và độ pha loãng chuẩn của kháng nguyên đều được thêm theo cặp vào các giếng liền kề theo hàng ngang (hoặc 3 lần lặp lại), sử dụng 2 (3) giếng cho mỗi độ pha loãng protein.
Việc ủ được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 30 phút với sự khuấy trộn liên tục. Quá trình rửa được thực hiện ít nhất 3-4 lần bằng dung dịch muối đệm phốt phát (pH 9,0) chứa 0,1% Tween-20 hoặc dung dịch đệm khác được chỉ định trong chuyên khảo dược điển hoặc tài liệu quy định.
- Ủ với kháng thể gắn với thẻ enzyme. 100 μl dung dịch kháng thể đặc hiệu liên hợp với nhãn enzyme được thêm vào các giếng của đĩa. Nồng độ tối ưu của kháng thể liên hợp thường được nêu trong chuyên khảo dược điển hoặc tài liệu quy định (thường sử dụng nồng độ 2–4 μg/ml).
Việc ủ với kháng thể chứa thẻ enzyme được thực hiện trong 30 phút ở nhiệt độ phòng bằng cách lắc trên máy lắc đĩa ngang.
Quá trình rửa được thực hiện ít nhất 3-4 lần bằng dung dịch muối đệm phốt phát (pH 9,0) chứa 0,1% Tween-20 hoặc dung dịch đệm khác được chỉ định trong chuyên khảo dược điển hoặc tài liệu quy định.
- Thực hiện phản ứng enzym kèm theo sự xuất hiện của sản phẩm có màu. Kỹ thuật thực hiện phản ứng enzyme tương tự như kỹ thuật được mô tả trong phần: “Phương pháp ELISA gián tiếp không cạnh tranh”.
Phát hiện
Như đã nêu ở trên, các kháng thể được dán nhãn enzyme hoặc thuốc thử khác được sử dụng để phát hiện. Ví dụ, thẻ enzyme có thể là peroxidase cải ngựa, phosphatase kiềm hoặc galactosidase. Các kháng thể hoặc kháng nguyên có nhãn khác có thể được sử dụng làm máy dò. Việc lựa chọn thuốc thử phát hiện phụ thuộc vào loại nhãn liên hợp với kháng thể hoặc kháng nguyên và phương pháp phát hiện.
Phương pháp đo quang phổ, phát quang hóa học, đo huỳnh quang và các phương pháp khác có thể được sử dụng làm phương pháp phát hiện, dựa trên việc lựa chọn nhãn.
Kết quả của phương pháp ELISA định lượng
Kết quả ELISA định lượng được tính toán từ đường cong hiệu chuẩn tuyến tính với hồi quy nghịch đảo hoặc bằng phương pháp phức tạp sử dụng đường cong hiệu chuẩn phi tuyến tính với hồi quy nghịch đảo. Phương pháp diễn giải kết quả phụ thuộc vào phương pháp ELISA được sử dụng. Ví dụ, kết quả thử nghiệm có thể được sử dụng để ước tính nồng độ của mẫu chưa biết, nồng độ ức chế tối đa một nửa hoặc nồng độ hiệu quả bằng cách sử dụng đường cong hiệu chuẩn. Điều này cho phép xác định lượng chất thử hoặc hoạt tính của nó so với chất chuẩn tham chiếu/hiệu chuẩn (RM). Thông thường, loại đường cong hiệu chuẩn khi thực hiện phương pháp ELISA định lượng, đặc trưng cho nồng độ của thuốc được phân tích, phụ thuộc phi tuyến tính vào giá trị trung bình được tính toán. Về vấn đề này, nên sử dụng các mô hình toán học khác nhau để phân tích đường cong kết quả. Trong các trường hợp khác, phương pháp ELISA được sử dụng như một phương pháp định tính cho phép đánh giá sự hiện diện của một chất thử cụ thể trong mẫu trong giới hạn độ nhạy của kỹ thuật.
Ghi chú.
Chuẩn bị dung dịch đệm cacbonat-bicacbonat (pH 9,6). Cho 1,59 g natri cacbonat (khan) hoặc 4,29 g natri cacbonat 10-dung dịch nước và 2,93 g natri bicarbonat vào ống đong dung tích 1000 ml, hòa tan trong 800 ml nước tinh khiết, điều chỉnh pH đến 9,6, trộn đều. , sau đó đưa thể tích dung dịch đến vạch bằng nước tinh khiết và trộn lại.
