(Hidrogazdinamik)
DOĞRUDAN SIZDIRMAZLIK ATLAMASI İLE GEÇİŞ SIRASINDA GAZ PARAMETRELERİNDEKİ DEĞİŞİM
Şok öncesi ve şok sonrası akış hızları arasında bir bağlantı kuralım. Bu amaçla dinamik denklemi (bkz. § 10.7) şu şekilde yeniden yazalım: R2 R Ve і - Ve2 ~ (10.64) r2i2 RShchŞoktan önce ve sonra uygulanan Bernoulli denklemleri (10.15) ve (10.24) şunu verir:(Hidrogazdinamik)
Devrimci dönüşümler ve "Büyük İleri Atılım"
Çin'in yabancı ve bürokratik sermayeye karşı devrimi 1924'ten 1949'a kadar 25 yıl sürdü ve üç iç savaş ve Japonya'ya karşı bir ulusal kurtuluş savaşından oluşuyordu. 1949'da Çin Halk Cumhuriyeti'nin ilanıyla sona erdi. Çin'de 25 yıldır savaşlar durmadı...(Ekonomi tarihi)
Sandviç duvar ve çatı panelleri
Sandviç paneller etkili bir yapı malzemesidir. "Sandviçler" Bina yapılarını, yüksek ısı yalıtım özelliklerini kapalı yapıların karakteristik diğer özellikleriyle (mekanik dayanım,...(Hafif sanayi işletmelerinin tasarımının temelleri)
KETEN KUMAŞLARIN MODİFİKASYONU
Tekstil malzemelerini değiştirme yöntemleriİnsanlık her zaman vücudunun sağlığını korumanın ve korumanın yollarını bulmaya çalışmıştır. Cildin durumu sağlık açısından büyük önem taşımaktadır. Bu nedenle tekstil malzemelerine uzun süredir artan ilgi gösteriliyor...Tekstil malzemelerini değiştirme yöntemleri
İnsanlık her zaman vücudunun sağlığını korumanın ve korumanın yollarını bulmaya çalışmıştır. Cildin durumu sağlık açısından büyük önem taşımaktadır. Bu nedenle, sürekli insan cildiyle temas halinde olduğundan tekstil malzemelerine uzun süredir daha fazla önem verilmektedir...(Keten kumaşların vücuda uyum sağlayıcı etkisi)
Başarılı yöneticilerin çalışanlara geri bildirim verirken kullandıkları yedi önemli kuralı paylaştım. Bu materyalde böyle bir konuşmayı etkili bir şekilde oluşturmanıza olanak tanıyan çeşitli modellere bakacağız. Kolaylık sağlamak için örnekler kullanacağız.
Geri bildirimin "sandviçi"
En ünlü model ve yaygın olarak kullanılmaktadır. Anlaşılması basit, hatırlanması kolay, kullanımı kolay.
Tanım: gelişimsel geri bildirim bloğu iki olumlu geri bildirim bloğu arasında yer alır. Dolayısıyla "sandviç" adı. Hedef belirleme, sonuçları ayarlama ve çalışanları geliştirme konusundaki konuşmalarda kullanılır. Tipik olarak disiplin konuşmaları, ihlal içeren durumlar, görevlerin yerine getirilmemesi ve çalışanın davranışında ayarlamaların gerekli olduğu durumlarda kullanılmaz.
Durum: Satış departmanının bir çalışanı olan Sergey, planı iki göstergeye göre (satış hacmi ve aktif müşteri sayısı) gerçekleştirdi. Ancak yeni ürünün satış hedefine ancak %50 oranında ulaşılabilmektedir.
Örnek:
Olumlu bir değerlendirmeyle başlayın.
“Sergey, bu ay satış hacmi planını %100 yerine getiren en çok satanlar grubuna dahil olduğunuzu belirtmek güzel. Görüyorum ki çok çalışmanız ve birçok müşteriyle ilişki kurmanız gerekiyor; aynı zamanda aktif müşteri sayısı açısından da lidersiniz.” Bu tür cesaret verici sözlerden sonra çalışan, iyileştirilmesi gereken çalışma alanlarını tartışmaya hazır olacaktır.
Neyin iyileştirilmesi ve değiştirilmesi gerektiğini tartışın ve bir eylem planı üzerinde anlaşın.
“Aynı zamanda hâlâ büyümek için yer var. Yeni markanın satışlarına dikkat edin. Bu ay planladığınızın yalnızca yarısını gerçekleştirdiniz. Artık şirketin bu ürünü pazara sunması önemli. Gelecek ay bu göstergeyi iyileştirmek için neler yapabileceğinizi tartışalım.” Hiçbir eleştirinin olmadığını unutmayın. Diyalog ve yapıcı tartışma var.
Konuşmayı olumlu bir notla sonlandırın. “Harika, plan üzerinde anlaşmaya varıldı, şimdi harekete geçelim. Müşterilerle çalışma yeteneğinizle bu görevi başarabileceğinize eminim. Unutmayın: Yeni bir markanın satışlarını artırırsanız, şu anda devam eden yarışmada ilk üçe girebilirsiniz. Yardıma ihtiyacın olursa içeri gel."
B.O.F.F.
Tanım: modelin dört aşamasının İngilizce adının baş harflerinin kısaltması. Davranış (Davranış) - Sonuç (Sonuç) - Duygular (Duygular) - Gelecek (Gelecek).
Durum: Müşteri hizmetleri departmanının yeni bir çalışanı olan Irina, düzenli olarak kaliteli hizmet standartlarını ihlal ediyor, yani: müşterileri selamlamıyor, kaba davranıyor, müşteri isteklerini görmezden geliyor, telefon çağrılarına cevap vermiyor ve öğle yemeği molalarına geç kalıyor.
Örnek:
Davranış.
Irina'ya çalışmaları hakkındaki gözlemlerinizi anlatın. Spesifik olarak, gerçekler diliyle, tercihen ayrıntılarla, gözlem tarihleriyle birlikte. Nedenlerini tartışın. Bazen bir çalışanın kendisinden ne beklendiğinin tam olarak farkında olmadığı görülür.
Sonuç.
Irina ile davranışlarının (müşterilerle çalışırken sinirlilik ve kabalık, istekleri göz ardı etme, aradan sonra uzun süre işe gelmeme) iş sonuçlarını, müşterilerden gelen şikayet sayısını ve hizmet verilen Müşteri sayısını nasıl etkilediğini tartışın.
Duygular.
Irina'nın bu şekilde çalıştığını bildiğinizde nasıl hissettiğinizi anlatın. Üzgünsün, üzgünsün, pek mutlu değilsin, bunun farkına varmak senin için hoş değil. Irina'nın işten uzun süre uzak kalması ve ek iş yüküyle çalışmak zorunda kalmaları durumunda diğer çalışanların nasıl hissettiklerini tartışın. Bunu yaparak Irina'nın davranışının kabul edilemez olduğunu anlamasına yardımcı olacaksınız.
Gelecek. Irina ile gelecekte bu davranışı ortadan kaldırmak için neler yapabileceğini tartışın. Çalışana soru sormak ve cevap almak en iyisidir. Bu onun gelecekteki kararların ve eylemlerin sorumluluğunu almasına olanak tanıyacaktır. Konuşmanın sonunda belirli eylemler ve son tarihler üzerinde anlaşın ve geleceğe yönelik bir eylem planının ana hatlarını çizin. Ve Irina'nın kendiniz üzerinde yapacağı çalışmayı özetleyeceğiniz bir toplantı tarihi planlamanız çok tavsiye edilir.
Tanım: Standart - Gözlem - Sonuç.
Durum: Teknik destek merkezinin bir çalışanı olan Andrey, iş geliştirme departmanından gelen sorun giderme talebine yanıt vermedi.
Örnek:
Standart.
Belirlenen standartları hatırlatın. “İkinci yıldır departmanımız hızlı yanıt standardına sahip; her türlü talebin 15 dakika içinde yanıtlanması gerekiyor. Bu, mutlaka bu 15 dakika içinde arızanın giderileceği anlamına gelmiyor ancak müşterimiz, başvurunun kabul edildiğine ve çalışmaya başladığımıza dair yanıt alacaktır.”
Gözlem.
Gerçekleri ve gözlemleri belirtin. “Dün saat 10:25'te iş geliştirme departmanından aldığınız başvuruya, müşteriden bugün saat 10:25'e kadar bir yanıt gelmedi. Sorun çözülmedi; hâlâ sisteme erişim sağlanamıyor.”
Sonuç. Davranışın işletme, ekip, müşteriler ve çalışanlar üzerindeki etkisini tartışın. “Sonuç olarak iş geliştirme departmanı dün büyük bir müşteriyle yapılan görüşmeleri ertelemek zorunda kaldı; hazırlık için gerekli bilgileri elde edemediler. Bu şirket için önemli bir müşteri ve bizim yavaşlığımızdan dolayı rakiplerle müzakerelere başlamayacaklarına dair hiçbir garantimiz yok.”
Çalışanın bir sonraki adımın kendi davranışını değiştirme taahhüdünde bulunması mantıklıdır.
Tanım: Başarılar - Dersler (Öğrenin) - Değişim (Değişiklikler). Bu geri bildirim modeli ekip çalışmasına çok iyi uyum sağlar: proje gruplarının nihai veya ara sonuçları özetlerken yaptığı çalışmalar, ekip toplantıları.
Durum: Proje ekibi yeni sistemin geliştirilmesinin ilk aşamasını tamamladı.
Örnek:
Her proje ekibi üyesinden, proje sırasında elde ettikleri en önemli 2 kişisel başarıyı, öğrendikleri en önemli 1 dersi ve projenin ikinci aşamasında yapmaları gereken 1 değişikliği listelemelerini isteyin. O zaman herkesin fikrini söylemesine izin verin. Liste yapın ve en önemli 5 başarıyı, 2 dersi ve en önemli 1 değişikliği seçin. Listedeki madde sayısı duruma ve proje ekibinin büyüklüğüne göre değişiklik gösterebilir.
Elbette bir çalışanla sohbeti yapılandırmanın başka birçok yolu vardır. Bu makale, pratikte en iyi bilinen ve başarıyla kullanılan geri bildirim modellerine genel bir bakış sunmaktadır.
Müşteri, değeri fiyatından yüksek olduğunda ürünü satın alır. Değer varsa ilgi de vardır. Ve bu durumda fiyat, bir ürüne olan talebin belirlendiği ölçüdür.
Fiyatı söylersiniz, “teşekkür ederim, düşüneceğim” diyorlar. Ancak teklife yeterince avantaj eklerseniz değer, fiyattan daha ağır basacaktır.
Satışta sandviç yöntemi
Bu durumda fiyat tereyağı gibidir, değerlerin üzerine ince bir tabaka halinde “yayılır”. Satışlarda sandviç yöntemi budur.
Bu teknik iki versiyonda kullanılır. Örneğin, fiyatı adlandırıyoruz ve ardından bu fiyata nelerin dahil olduğunu söylüyoruz:
“Ürünün fiyatı XXX. Bu fiyata cihazın kendisi ve bir dizi yedek parça dahildir. Üstelik ücretsiz teslimat ve kurulum da sağlıyoruz. Teklifimizin garantisi, çoğu durumda benzer ürünlerde olduğu gibi bir yıl değil, üç yıldır.”
Veya tam tersi - önce avantajlardan bahsederiz ve fiyatı sonraya "kaydederiz". Örneğin tanınmış bir şirket web uzmanlarına yönelik kurslar sunuyordu. Kartvizit sayfasında teklif ayrıntılı olarak açıklanıyor - hazır uzmanlar için yüksek düzeyde gelir ve yüksek talep, birçok sektörde faydalı olacak bir dizi beceri, kısa eğitim süresi ve büyük şirketlerde staj. Açıklama, kursta uzmanlaşmak için ihtiyacınız olan tek şeyin arzu olduğunu söylüyor. Öğrenme süreci basittir; tek ihtiyacınız olan bir İnternet bağlantısıdır. Öğrencilerin önemli bir kısmı öğrenimleri sırasında bu alandaki potansiyellerini hayata geçirme fırsatı bulmaktadır. Eğitimi tamamlayan kullanıcıların geri bildirimleri de verilmektedir.
Sayfanın sonunda - kartvizitler bir kez daha tüm avantajların listesi, kalan yer sayısı şeklinde özetlenmiştir. Ve başvuru formunun hemen öncesinde fiyat veriliyor - kursun ücretsiz olmadığı ortaya çıkıyor. Ancak ilgilenen kullanıcı fiyata ulaşana kadar tüm avantajlarla tanışma fırsatına sahiptir.
Satışta sandviç yöntemi
Satışlarda sandviç yöntemi biraz farklı görünüyor - fiyatı teklifin ortasına "yerleştiriyoruz". İlk önce “faydalar”dan bahsediyoruz, avantajlardan, fiyatın adını koyuyoruz ve sonunda daha fazla avantaj ekliyoruz. Psikolojik etkinin hesaplanması - birkaç argüman varsa, ilk ve sonuncusu hatırlanır. Ortada gelen argümanlar müşterinin dikkatini "düşer".
Sandviç yöntemi pratikte nasıl görünebilir:
Yukarıdaki örnek çevrimiçi bir kurs sunmakla ilgili; fiyat açıklandıktan sonra birkaç “güzellik” daha ekleniyor. Örneğin, yüksek nitelikli öğretmenlerden, gelişmiş bir geri bildirim sisteminden, bireysel eğitim planı olasılığından ve devlet lisansından bahsediyor.
Bu durumda fiyat, değerler arasında ince bir katman gibidir ve önemsiz bir şey gibi görünebilir.
Gelirse işleme koyarız.
Sosyal ağlarda paylaşın
Daha fazlasını öğrenin
- Altın standart nedir ve doğrudan satışlarda neden gereklidir? Ağırlık, boyut konusunda standartlar var...
Verilen örnekler öncelikle bir yönetici ile bir ast arasındaki ilişkiye ilişkindir ancak sonuçlar diğer durumlara da genişletilebilir (örneğin, eşler arasındaki iletişim).
Birçok yönetici astlarını eleştirmekten korkuyor
Fikir alışverişi, bir yönetici ile bir ast arasındaki ilişkinin ana bileşenidir, ancak çoğu zaman yöneticiler, astlarının çalışmaları hakkında yapıcı (olumsuz) bir değerlendirme yapmaktan korkarlar. Olumsuz geribildirimin çalışanları rahatsız edeceğini ve ilişkilerin temelini oluşturan güven ilkesini ihlal edeceğini düşünüyorlar. Kural olarak bu tür liderler memnuniyetsizliklerini kendilerine saklarlar. Çeşitli durumlarda sessiz kalırlar, gecikmelere, uygunsuz görünüm ve davranışlara (özellikle karşı cinsten çalışanlara) göz yumarlar.
Sandviç Eleştirisinin Garantili Faydaları
Sandviç ilkesi, olumsuz söz ve yorumların ifade edilmesini kolaylaştıran popüler bir tekniktir. Bu durumda ifade “övgü - eleştiri - övgü” şemasına göre yapılandırılmıştır. Başka bir deyişle sandviç ilkesi, olumsuz noktaların olumlu noktalarla karıştırılarak tartışılmasını içerir.
Bu yöntemin avantajı şudur:
- Eleştiriyi yumuşatır ve algılanmasını kolaylaştırır.
- Garip anları tartışırken konuşmacının daha güvende hissetmesini sağlar (örneğin, bir yöneticinin bir çalışana davranış sorunlarını anlatması gerekiyorsa övgüyle başlaması onun için daha kolay olacaktır).
Sandviç prensibi. örnek 1
Andy yakın zamanda bir finansal danışmanlık şirketinde işe girdi ve New York'ta bir haftalık staj teklifi aldı. Andy otelde kaldı ve her gece izleme başına ödemeli filmler izledi. Bu ona 65 dolara mal oldu ve bunu yolculuk gider raporuna dahil etti. Ayrıca Andy pahalı restoranlarda yemek yiyordu.
Andy'nin patronu Jean raporunu aldı. Açıkçası, filmler için ödeme yapmak şirketin mali planının bir parçası değildi. Jean, ödemeyi reddetmek ve Andy'den seyahatlerinde daha akıllıca harcama yapmasını istemek için sandviç ilkesini kullandı.
Övgü: “Andy, geçen ayki profesyonel gelişiminden çok etkilendim. New York'ta edindiğiniz bilgileri müşterilerinizin finansal belgeleriyle çalışmak için aktif olarak kullandığınızı görüyorum."
Kritika: “Bu arada bu sabah New York'tan dönerken sunduğunuz rapora baktım. Otelde filmlere 65 dolar harcadığınız yazıyor. Bütçemizde böyle bir gider kalemi bulunmadığı için size ödeme yapmayı reddetmek zorunda kalıyorum. Ayrıca akşam yemeği için çok pahalı yemekler sipariş ettiniz. Bu sefer onların parasını biz ödeyeceğiz ancak seyahat bütçesinin kısıtlı olduğunu dikkate alarak harcamalarınızda daha dikkatli olmanızı rica ediyorum. Büyük olasılıkla, şirketimizin politikasını tanımak için henüz zamanınız olmadı. İK temsilcilerinden kabul edilebilir harcama düzeyini açıklayan belgelerin bir kopyasını size vermelerini istedim."
Övgü: “Ama New York gezisinin işinize yaramasına sevindim. Müşterilerle iletişim kurma konusundaki sıkı çalışmanızı ve gayretinizi takdir ediyorum. Aynen böyle devam!"
Sandviç prensibi. Örnek 2
Sofya, önemli projelerin ayrıntılarının tartışıldığı genel toplantıların düzenlenmesinden sorumludur. Genellikle toplantıdan önce konuyu asla duyurmaz. Bir toplantıdan sonra Sophia'nın yöneticisi, onu organizasyonel süreci iyileştirmeye teşvik etmek için sandviç ilkesini kullandı.
Övgü: “Sofia, toplantı harikaydı! Tüm departmanlardan temsilciler katıldı ve gerekli tüm bilgileri aldık. Harika bir organizatörsünüz, teşekkür ederim!”
Eleştiri: “Tartışmanın bazen kopuk olduğunu fark ettiniz mi? Toplantıdan önce konuyu duyurmazsanız katılımcılar hazırlık yapamazlar. Kağıtlarını karıştırmak, belge bulmak için koşmak vb. zorunda kalıyorlar. Ayrıca sık sık rotadan sapıyor ve konu dışı konuşmalara çok zaman harcıyoruz. Bunun önlenebileceğini düşünüyor musunuz? Konuyla ilgili bir tartışma aşağıdadır.
Övgü: “Harika bir iş çıkarıyorsun! Her şeyi organize etme ve meslektaşlarınızdan alınan verileri etkili bir şekilde kullanma konusunda harika olmanızı gerçekten seviyorum.”
Çözüm
Sandviç prensibi, yöneticinin bir yorumu söylemeyi ve anlamayı kolaylaştıracak şekilde yeniden ifade etmesine olanak tanır. İyi davranışları ödüllendirir ve olumlu değişimi teşvik eder.
Olga Airapetova'nın çevirisi
GENEL FARMAKOPE MAKALE
İlk kez tanıtıldı
Bu genel farmakope monografisi, enzime bağlı immünosorbent tahlili (ELISA) yöntemi için geçerlidir. ELISA yöntemi, bir antijen, hapten (eksik antijen) veya antikor özelliklerine sahip çeşitli maddelerin niteliksel ve niceliksel olarak belirlenmesini gerçekleştirmek için kullanılan, oldukça hassas ve oldukça spesifik bir immünodiyagnostik yöntemdir. ELISA yöntemi, insanlarda ve hayvanlarda bulaşıcı ve bulaşıcı olmayan hastalıkların teşhisinde yaygın olarak kullanılmaktadır ve ayrıca immünbiyolojik tıbbi ürünlerin (IBP'ler) kalitesini doğrulamak için de kullanılabilir.
Yöntemin prensibi, bir antijenin bir antikorla spesifik etkileşimi ile bir bağışıklık kompleksinin oluşması ve ardından ortaya çıkan kompleksin spektrofotometri, kemilüminesans ve diğer yeterli teknikler kullanılarak saptanmasıdır. Tespit ya doğrudan (test maddesinin kendisi enzimatik aktiviteye sahip olduğunda ya da bir enzim etiketi ile etiketlendiğinde) ya da dolaylı ya da dolaylı (katı faz üzerinde immobilize edilmiş antikorlara bağlanan test maddesi enzim etiketli bir madde ile inkübe edildiğinde) olabilir. antikorlar). Kalitatif analiz, "evet/"hayır" ilkesine göre incelenen materyaldeki antijen veya antikor içeriği hakkında bilgi edinmenizi sağlar. Kantitatif bir analiz yapılırken, test materyalindeki antijen veya antikor konsantrasyonu bir kalibrasyon grafiği kullanılarak belirlenir.
GENEL HÜKÜMLER
ELISA yöntemi 3 ana aşamayı içerir: 1) bir bağışıklık kompleksi “antijen (test maddesi) – ona özgü antikor” oluşumu veya bunun tersi; 2) konjugat ile önceki aşamada oluşturulan bağışıklık kompleksi arasında veya serbest bağlanma bölgeleri (belirleyiciler) arasında bir bağın oluşması; 3) bir enzim etiketinin etkisi altında substratın, biyokimyasal bir reaksiyonun sonucu olarak kayıtlı bir sinyale dönüştürülmesi.
Enzim immünoanalizlerini gerçekleştirmek için kullanılan tüm yöntemler homojen veya heterojen olarak sınıflandırılır.
ELISA'nın 3 aşamasının tamamının çözelti içinde gerçekleştiği ve ana aşamalar arasında, oluşan bağışıklık komplekslerini reaksiyona girmemiş bileşenlerden ayırmak için hiçbir ek adımın bulunmadığı yöntemler, homojen ELISA yöntemleri grubuna aittir. Kural olarak düşük moleküllü maddelerin belirlenmesi için kullanılan homojen ELISA'nın temeli, bir antijen veya antikorla birleştiğinde enzimin aktivitesinin inhibe edilmesi işlemidir. Antijen-antikor reaksiyonunun bir sonucu olarak enzim aktivitesi geri yüklenir. Bir enzim etiketi içeren bir antijen-antikor immün kompleksi oluştuğunda, enzim aktivitesi, substratın enzimin aktif merkezinden sterik olarak dışlanmasına bağlı olarak yüksek molekül ağırlıklı substrata göre %95 oranında inhibe edilir. Antijenin konsantrasyonu arttıkça, giderek daha fazla antikor bağlanır ve yüksek moleküler ağırlıklı substratı hidrolize etme kapasitesine sahip, giderek daha fazla serbest antijen-enzim konjugatı kalır. Homojen ELISA yöntemi çok hızlıdır. Bir tanımı analiz etmek 1 dakika sürer. Yöntemin duyarlılığı oldukça yüksektir. Pikomol seviyesinde bir maddeyi belirlemek için kullanılabilir.
Heterojen yöntemler, katı bir taşıyıcı fazın katılımıyla iki fazlı bir sistemde analiz ve farklı fazlarda (oluşturulan bağışıklık kompleksleri katı üzerindedir) bağışıklık komplekslerinin reaksiyona girmemiş bileşenlerden (yıkama) ayrılmasının zorunlu bir aşaması ile karakterize edilir. fazdadır ve reaksiyona girmemiş kompleksler çözelti halindedir). İlk aşamada immün kompleks oluşumunun katı fazda gerçekleştiği heterojen yöntemlere katı faz yöntemleri denir.
Aşama 1 - spesifik komplekslerin oluşumu - çözelti içinde meydana gelirse ve daha sonra bileşenleri ayırmak için hareketsizleştirilmiş bir reaktifle katı bir faz kullanılırsa, yöntemler homojen-heterojen olarak sınıflandırılır.
Heterojen ELISA yöntemi 3 ana adımdan oluşur:
- bir antijenin veya antikorun katı bir faz üzerinde immobilizasyonu, ortaya çıkan komplekse immünosorbent adı verilir;
- bağlanmamış reaktifin çıkarılması ve albümin, kazein gibi bloke edici proteinler kullanılarak katı bir destek üzerindeki bağlanma bölgelerinin bloke edilmesi; analiz edilen ilacın, bağlanmalarının gerçekleşmesi için bir immünosorban ile inkübasyonu;
3) test maddesinin kendisinin enzimatik aktivitesine bağlı olarak veya analiz edilen ilaçla ilişkili enzimatik etikete bağlı olarak tespit (doğrudan versiyon). Bazı durumlarda, "immünosorbent-test maddesi" kompleksinin bir enzimatik etikete konjuge edilmiş ikincil antikorlarla ilave inkübasyonu gerçekleştirilir (dolaylı seçenek).
Test maddesinin kantitatif tespiti, kullanılan dedektöre uygun bir substratın eklenmesi ve test maddesinin sinyalinin standart bir numuneyle karşılaştırılması yoluyla gerçekleştirilir.
Heterojen ELISA yöntemi, rekabetçi olmayan ELISA ve rekabetçi ELISA olarak ikiye ayrılır. Test şemaları, ilaç geliştirme süreci sırasında gerekli gereksinimlere uygun olarak değiştirilebilir. Değişiklikler farmakope monografisinde veya düzenleyici belgelerde belirtilmelidir. ELISA yönteminin seçimi, test maddesinin doğasına ve miktarına bağlıdır çünkü farklı ELISA türleri farklı hassasiyetlere sahiptir. Antikor içeren maddelerin kalitesini değerlendirmek için spesifik anti-idiyotipik antikorların kullanılması mümkündür.
Rekabetçi olmayan ELISA yöntemi
Rekabetçi olmayan ELISA yöntemi, tespit türüne (doğrudan rekabetçi, dolaylı (dolaylı) rekabetçi) ve katı fazda immobilize edilen maddenin türüne (antijen veya antikor) göre çeşitli türlere ayrılır.
Doğrudan ELISA seçeneği
2 şekilde yapılabilir. İlk durumda, test maddesi (antijen) doğrudan katı faz üzerinde immobilize edilir; daha sonra antijene bağlanan etiketli antikor dedektördür. Testi farklı bir şekilde gerçekleştirirken katı fazda immobilize edilmiş antikorlar kullanılır. Bu durumda dedektör, bir enzimle etiketlenmiş test maddesidir.
ELISA'nın dolaylı (dolaylı) versiyonu
ELISA'nın dolaylı versiyonunu gerçekleştirirken antijen katı fazda immobilize edilir. Bloke edildikten sonra antijene kendisine özgü bir antikor çözeltisi eklenir. İnkübasyondan sonra ortaya çıkan antijen-antikor kompleksi, bağlanmamış antikorlardan yıkanır ve bir dedektör görevi gören enzim etiketli anti-immünoglobulin (anti-Ig) eklenir. Anti-Ig detektörleri, spesifik Ig sınıfları ve alt sınıfları için ticari olarak temin edilebilir, bu da bu tahlil formatını antikor izotipleme için uygun hale getirir. Ek olarak, etiketli anti-Ig'nin kullanımı, doğrudan enzime bağlı immünosorbent tahlil yöntemiyle karşılaştırıldığında sinyali güçlendirir, böylece tahlilin duyarlılığını arttırır.
ELISA gerçekleştirmek için bir seçenek olarak “sandviç” yöntemi
Rekabetçi olmayan en yaygın yöntem sandviç yöntemidir. Gerçekleştirildiğinde, birincil antikorlar katı fazda hareketsiz hale getirilir ve ardından bloke edilir. Daha sonra antijeni içeren test maddesi bunlara eklenir ve inkübe edilir. İnkübasyondan sonra antijen-antikor kompleksi yıkanarak bağlanmamış antijenden uzaklaştırılır ve bir enzimle işaretlenmiş ikincil antikorlar eklenir ve tespit gerçekleştirilir.
Rekabetçi ELISA yöntemi
Rekabetçi ELISA yöntemi birkaç türe ayrılır: tespit türüne (doğrudan rekabetçi, dolaylı (dolaylı) rekabetçi) ve katı fazda hareketsiz hale getirilen maddenin türüne (antijen veya antikor) göre.
Doğrudan rekabetçi ELISA
Çözünür antijenleri saptamak veya ölçmek için ELISA'nın katı fazda immobilize edilmiş bir antijenle doğrudan rekabetçi bir versiyonu kullanılır. Bunu yapmak için uygun bir dedektöre (örneğin yaban turpu peroksidaz, alkalin fosfataz, rutenyum veya floresein) konjuge edilmiş antijene özgü antikorlar kullanın. Standart bir antijen katı faz üzerine immobilize edilir ve ardından bloke edilir. Bir enzimatik etikete konjuge edilen antikor, test maddesi (çözünür antijen) ile inkübe edilir. Bu karışım daha sonra hareketsizleştirilmiş antijene eklenir, inkübe edilir ve daha sonra bağlanmamış antijen-antikor kompleksini çıkarmak için yıkanır. Bir sonraki adım, etiket olarak kullanılan enzim için uygun bir substratın eklenmesidir. Rekabetçi çözünebilir antijeni olmayan bir kontrol numunesi ile karşılaştırıldığında, sistemde 2 antijenin varlığı nedeniyle reaksiyonun inhibisyonu, test maddesinin miktarıyla ters orantılıdır.
Doğrudan rekabetçi katı faz antikor ELISA, doğrudan rekabetçi katı antijen ELISA'ya benzer, ancak antikorları tespit etmek veya ölçmek için kullanılır.
Dolaylı (dolaylı) rekabetçi ELISA varyantı
Bu ELISA yöntemi, doğrudan rekabetçi versiyona benzer, ancak etiketli bir antikor veya antijen yerine, saptama için sırasıyla etiketli bir anti-Ig reaktifi veya etiketli ikincil antikorlar kullanılır.
Yöntemi gerçekleştirmek için genel koşullarELISA
Enzim immünolojik tahlili için katı faz olarak çeşitli malzemeler kullanılır: silikon, nitroselüloz, poliamitler, polistiren, polivinil klorür, polipropilen, akrilik ve diğerleri. Katı faz, bir test tüpünün duvarları, 96 oyuklu ve diğer plakalar, toplar, boncukların yanı sıra nitroselüloz ve proteinleri aktif olarak emen diğer membranlar olabilir. İmmobilizasyon prensibi (hidrofobik, hidrofilik, kovalent etkileşim) katı faz seçimine bağlıdır. Çoğu zaman, katı faz olarak 96 oyuklu plastik mikrotitre plakaları kullanılır. Plakadaki kuyucukların sayısı değişebilir. Tablet şeffaf (kolorimetrik algılama) veya mat (kemilüminesans algılama, florimetri) olabilir.
Hareketsizleştirme kuyuda hava kabarcıkları olmadan gerçekleştirilmelidir çünkü bunların varlığı optik yoğunluk okumasını değiştirir. Biyotinlenmiş immobilize reaktiflerin kullanılması mümkündür. Bu durumda reaksiyonda streptavidin ve biyotinlenmiş bir enzim etiketi kullanılır. Bu yöntem sinyali yükseltmek için kullanılır. Reaktifin kinetik yapısına, stabilitesine ve konsantrasyonuna bağlı olarak immobilizasyonun süresi ve sıcaklığı, farmakope monografisinde ve düzenleyici belgelerde belirtilmelidir.
Enzim immün testinin tüm aşamaları, yıkama ve bloke etme solüsyonları, her aşama için zaman aralıkları ve sıcaklık koşulları, çalkalayıcıda inkübasyon için dakikadaki devir sayısı, tespit koşulları da farmakope monografında ve düzenleyici belgelerde belirtilmelidir.
Bazı ELISA türleri için yöntem örnekleri
Dolaylı rekabetçi olmayan ELISA yöntemi
- Antijen emilimi. Farmakope monografisinde veya düzenleyici belgelerde aksi belirtilmediği sürece, 96 kuyulu bir plakanın her oyuğuna 0,1-0,5 μg antijen ve 100 ul 0,05 M karbonat-bikarbonat tampon çözeltisi (pH 9,6) ekleyin ve ardından belirli bir sıcaklıkta sorpsiyon gerçekleştirin. 4 °C sıcaklıkta 16 saat süreyle pH değeri yüksek diğer tampon çözeltileri kullanmak mümkündür. Kuluçkalama yatay bir plaka çalkalayıcı üzerinde çalkalanarak gerçekleştirilir.
Bağlanmamış antijen moleküllerinin yıkanması (iki kez), farmakope monografında veya düzenleyici belgelerde aksi belirtilmediği sürece, %0,1 Tween-20 (oyuk başına 300 ul) içeren fosfat tamponlu salin çözeltisi (pH 9,0) ile gerçekleştirilir.
- Engelleme. Antijenlerin veya antikorların spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke etmek için tabletin kuyuları, fosfat tamponlu salin solüsyonu (pH 9,0) veya %1 sığır serumu solüsyonu içeren farmakope monografisinde veya düzenleyici belgelerde belirtilen başka bir tampon solüsyonu ile doldurulur. albümin veya diğer proteinler (kazein, jelatin, süt tozu vb.) ve oda sıcaklığında 10-15 dakika inkübe edin (farmakope monografisinde veya düzenleyici belgelerde aksi belirtilmediği sürece).
III. Spesifik antikorların titrasyonu. Kantitatif değerlendirme gerekliyse test maddesi (antijen veya antikor), standart numuneye (RM) paralel olarak seri seyreltmelerle titre edilir.
Titrasyon plakanın hem yatay hem de dikey sıralarında gerçekleştirilebilir. Optimum antikor konsantrasyonunu seçmek veya titrelerini belirlemek gerekirse, antikor titrasyonunun gerçekleştirildiğine dikkat edilmelidir. Antikorların optimal konsantrasyonu ve/veya titresi belirlenirse bu antikorlar (serum) için önerilen seyreltme kullanılır.
Titre ederken, serinin ilk kuyucuğuna hazır bir antikor seyreltmesi eklenir - kuyucuk başına ortalama 1-10 μg, daha sonra kuyucuklarda antikorların sıralı seyreltilmesi gerçekleştirilir. Spesifik antikorlarla inkübasyon, yatay bir plaka çalkalayıcı üzerinde çalkalanarak oda sıcaklığında 30 dakika süreyle gerçekleştirilir.
Yıkama, %0,1 Tween-20 içeren pH 9,0 fosfat tamponlu salin solüsyonu kullanılarak en az 3-4 kez gerçekleştirilir.
- Bir enzim etiketine konjuge edilmiş tür karşıtı (antiglobulin) antikorların eklenmesi. Bir enzimatik etikete konjuge edilen tür karşıtı poliklonal antikorlar, dedektör (ikincil) antikorlar olarak kullanılır. Çoğu zaman, molekülün tamamına veya spesifik antikorların Fc fragmanlarına özgü keçi veya tavşan antikorları kullanılır. Dedektör antikorlarının konsantrasyonu genellikle üretici tarafından stok solüsyonun seyreltilmesi olarak belirtilir (örneğin, 1:1000).
Etiketli ikincil antikorlarla inkübasyon, yatay bir plaka çalkalayıcı üzerinde çalkalanarak oda sıcaklığında 30 dakika süreyle gerçekleştirilir.
Yıkama, %0,1 Tween-20 içeren fosfat tamponlu salin solüsyonu (pH 9,0) kullanılarak en az 3-4 kez gerçekleştirilir.
Kuluçkalama, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca gerçekleştirilir ve yatay bir plaka çalkalayıcı üzerinde çalkalanır.
- Kuyucuklara 100 µl substrat solüsyonu eklenir ve oda sıcaklığında ve sürekli karıştırılarak 10 dakika inkübe edilir. Enzimatik reaksiyonu durdurmak için tüm test ve kontrol örneklerine eşit miktarlarda eklenen bir "durdurma reaktifi" kullanılır. Sülfürik asit çoğunlukla "durdurma reaktifi" olarak kullanılır.
Doğrudan rekabetçi olmayan ELISA yöntemi
Doğrudan ELISA yönteminin dolaylı, rekabetçi olmayan ELISA yönteminden yalnızca küçük farklılıkları vardır. Dolayısıyla aşama I ve II her iki analiz türünde de aynıdır. Aradaki fark, ELISA'nın doğrudan versiyonunda, aşama III'te, test antijenine özgü antikorların kullanılması, bir enzim etiketine konjuge edilmesi ve bunların test maddesiyle doğrudan etkileşime girmesidir. Gerekirse konjugelerin titrasyonu, daha önce konjuge olmayan antikorlar için açıklanan prensibe benzer şekilde gerçekleştirilebilir. Doğrudan rekabetçi olmayan ELISA'nın IV. Aşaması yapılmaz.
"Sandviç" yöntemi ELISA
ELISA'nın bu versiyonu, incelenen antijenin uzaysal olarak uzak epitoplarına özgü bir çift antikor (birincil ve ikincil) kullanır.
- Antikorların katı fazda soğurulması. Antijen sorpsiyon tekniği, “Dolaylı rekabetçi olmayan ELISA yöntemi” bölümündeki antikor sorpsiyon tekniğine benzer.
- Engelleme. Substrat (katı faz) üzerindeki spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke etme tekniği, "Dolaylı rekabetçi olmayan ELISA yöntemi" bölümünde açıklanan bloklama tekniğine benzer.
III. Antijen ile inkübasyon. Farmakope monografında veya düzenleyici belgelerde aksi belirtilmediği sürece, önceden adsorbe edilmiş antikorların bulunduğu plakanın oyuklarına 50 ul test maddesi ve standart antijen seyreltmeleri eklenir. Antijen dilüsyonları, %0,1 Tween-20 içeren fosfat tamponlu salinde (pH 9,0) hazırlanmalıdır çünkü Tween-20, protein moleküllerinin birbirine ve plaka yüzeyine spesifik olmayan bağlanmasını azaltır. Hem test maddesi hem de antijenin standart dilüsyonları, her protein seyreltisi için 2 (3) kuyucuk kullanılarak, yatay bir sıra halinde (veya 3 kopya halinde) bitişik kuyucuklara çiftler halinde eklenir.
Kuluçkalama, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca sürekli karıştırılarak gerçekleştirilir. Yıkama, %0,1 Tween-20 içeren fosfat tamponlu salin solüsyonu (pH 9,0) veya farmakope monografında veya düzenleyici belgelerde belirtilen başka bir tampon solüsyonu ile en az 3-4 kez gerçekleştirilir.
- Bir enzim etiketine konjuge edilmiş antikorlarla inkübasyon. Plakanın oyuklarına, bir enzim etiketine konjuge edilmiş spesifik antikorlardan oluşan 100 ul'lik bir çözelti eklenir. Konjuge antikorların optimal konsantrasyonu genellikle farmakope monografisinde veya düzenleyici belgelerde belirtilir (genellikle 2-4 μg/ml'lik bir konsantrasyon kullanılır).
Bir enzim etiketi içeren antikorlarla inkübasyon, yatay bir plaka çalkalayıcı üzerinde çalkalanarak oda sıcaklığında 30 dakika süreyle gerçekleştirilir.
Yıkama, %0,1 Tween-20 içeren fosfat tamponlu salin solüsyonu (pH 9,0) veya farmakope monografında veya düzenleyici belgelerde belirtilen başka bir tampon solüsyonu kullanılarak en az 3-4 kez gerçekleştirilir.
- Renkli bir ürünün ortaya çıkmasıyla birlikte enzimatik bir reaksiyonun gerçekleştirilmesi. Enzimatik reaksiyonu gerçekleştirme tekniği, "Dolaylı, rekabetçi olmayan ELISA yöntemi" bölümünde açıklanan tekniğe benzer.
Tespit etme
Yukarıda belirtildiği gibi, tespit için bir enzim etiketi veya başka bir reaktifle etiketlenmiş antikorlar kullanılır. Enzim etiketi örneğin yaban turpu peroksidaz, alkalin fosfataz veya galaktosidaz olabilir. Diğer etiketlere sahip antikorlar veya antijenler dedektör olarak kullanılabilir. Dedektör reaktifinin seçimi, antikora veya antijene konjuge edilmiş etiketin tipine ve tespit yöntemine bağlıdır.
Etiket seçimine bağlı olarak spektrofotometri, kemilüminesans, florimetri ve diğer yöntemler tespit yöntemleri olarak kullanılabilir.
Kantitatif ELISA yönteminin sonuçları
Kantitatif ELISA sonuçları, ters regresyonlu doğrusal bir kalibrasyon eğrisinden veya ters regresyonlu doğrusal olmayan bir kalibrasyon eğrisi kullanan karmaşık bir yöntemle hesaplanır. Sonuçların yorumlanması yöntemi kullanılan ELISA yöntemine bağlıdır. Örneğin, test sonuçları bilinmeyen bir numunenin konsantrasyonunu, yarı maksimum inhibisyon konsantrasyonunu veya bir kalibrasyon eğrisi kullanarak etkili konsantrasyonu tahmin etmek için kullanılabilir. Bu, test maddesi miktarının veya aktivitesinin bir referans/kalibrasyon standardına (RM) göre belirlenmesine olanak tanır. Tipik olarak, analiz edilen ilacın konsantrasyonunu karakterize eden kantitatif bir ELISA yöntemi gerçekleştirilirken kalibrasyon eğrisinin türü, doğrusal olmayan bir şekilde hesaplanan ortalama değere bağlıdır. Bu bağlamda ortaya çıkan eğriyi analiz etmek için çeşitli matematiksel modellerin kullanılması önerilmektedir. Diğer durumlarda ELISA yöntemi, tekniğin hassasiyet sınırları dahilinde bir numunedeki belirli bir test maddesinin varlığının değerlendirilmesine olanak tanıyan niteliksel bir yöntem olarak kullanılır.
Not.
Karbonat-bikarbonat tampon çözeltisinin hazırlanması (pH 9,6). 1000 ml kapasiteli bir ölçüm silindirine 1,59 g sodyum karbonat (susuz) veya 4,29 g sodyum karbonat 10-sulu ve 2,93 g sodyum bikarbonat ekleyin, 800 ml saf su içinde çözün, pH'ı 9,6'ya ayarlayın, karıştırın , ardından çözeltinin hacmini arıtılmış suyla işarete getirin ve tekrar karıştırın.
